Глюкоза оксидазная что это

Глюкозооксидаза

Глюкозооксидаза, D-глюкозо-1-оксидаза (КФ 1.1.3.4) — фермент, окисляющий β-D-глюкозу до глюконо-1,5-лактона, который спонтанно гидролизуется до глюконовой кислоты. При этом образуется пероксид водорода.

Содержание

Структура

Глюкозооксидаза — это димерный белок, который содержит в качестве кофактора флавинадениндинуклеотид (ФАД), распространённый компонент окислительно-восстановительных реакций.

Фермент имеет эллиптическую форму. Состоит из 580 остатков аминокислот, ФАД-кофактор, шесть N-ацетилглюкозаминных остатков и три остатка маннозы. Размеры молекулы: 6,0нм X 5,2нм X 7,7нм. [1]

В процессе реакции ФАД принимает два электрона и восстанавливается до ФАД-H₂. Затем оба электрона с ФАД-H₂ переходят на молекулярный кислород с образованием ФАД и пероксида водорода.

Применение

Глюкозооксидаза может переносить электроны не только на кислород, но и на металлы, поэтому этот фермент широко используется в биосенсорах для измерения уровня глюкозы. Такие биосенсоры составляют центральную часть приборов, определяющих уровень сахара, например, в крови у больных диабетом.

См.также

Примечания

Внешние ссылки

Полезное

Смотреть что такое «Глюкозооксидаза» в других словарях:

глюкозооксидаза — глюкозооксидаза … Орфографический словарь-справочник

глюкозооксидаза — іменник жіночого роду … Орфографічний словник української мови

ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА — основаны на использовании хим. р ций с участием ферментов. О содержании определяемого компонента судят либо по кол ву конечного продукта ферментативной р ции, либо, чаще, по начальной скорости процесса, положенного в основу методики определения… … Химическая энциклопедия

Оксидазы — ферменты класса оксидоредуктаз (См. Оксидоредуктазы); широко распространены в природе, катализируют в живых клетках окислительно восстановительные реакции, в которых акцептором водорода служит кислород воздуха. При переносе на O2 водорода … Большая советская энциклопедия

Радика́лы свобо́дные — атомы или группы химически связанных атомов, обладающие свободными валентностями, т.е. неспаренными (нескомпенсированными) электронами на внешней (валентной) орбитали. Наличие неспаренных электронов определяет высокую химическую реакционную… … Медицинская энциклопедия

ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ СЕНСОРЫ — устройства, в к рых аналит. сигнал обеспечивается протеканием электрохим. процесса. Предназначены для качеств. и количеств. анализа хим. соед. в жидких и газообразных средах. По сравнению с обычными аналит. приборами отличаются портативностью,… … Химическая энциклопедия

Пищевые добавки — Пищевые добавки вещества, которые в технологических целях добавляются в пищевые продукты в процессе производства, упаковки, транспортировки или хранения для придания им желаемых свойств, например, определённого аромата (ароматизаторы),… … Википедия

Список пищевых добавок E1000-E1999 — E1000 E1999 Пищевые добавки. Дополнительные вещества. В том числе антифламинги. Индекс Название вещества Английское название Технологические функции E1000 Холевая кислота en:Cholic Acid эмульгатор E1001 … Википедия

Е1000-Е1521 — Пищевые добавки Пищевые красители E1xx | Консерванты E2xx | Антиокислители и регуляторы кислотности E3xx | Стабилизаторы, загустители и эмульгаторы E4xx | Регуляторы рН и вещества против слёживания E5xx | Усилители вкуса и аромата, ароматизаторы… … Википедия

Е1000-Е1999 — Пищевые добавки Пищевые красители E1xx | Консерванты E2xx | Антиокислители и регуляторы кислотности E3xx | Стабилизаторы, загустители и эмульгаторы E4xx | Регуляторы рН и вещества против слёживания E5xx | Усилители вкуса и аромата, ароматизаторы… … Википедия

Источник

Определение глюкозы глюкозооксидазным методом

Когда назначается проведение глюкозооксидазного метода?

Этот тест используют для выявления нарушения толерантности к сахару и развития преддиабета, а также в стадии разгара болезни. Но для таких целей анализ используют редко, это связано с его высокой стоимостью и длительным ожиданием результата. Чаще всего определение глюкозы в крови и моче с помощью этого метода применяют при дифференциальной диагностике таких заболеваний, как:

Несомненным достоинством глюкозооксидазного теста является его точность.

Вернуться к оглавлению

Необходимые реактивы для определения глюкозы глюкозооксидазным методом

1. Натрия хлорида 9 грамм/литр(изотонический раствор): готовят, раст­воряя 0,9 г NaCl в 100 мл воды.

2. Цинка сульфат, 50 г/л: 5 г сульфата цинка (ZnSO4) растворя­ют в воде, объем доводят до 100 мл.

3. Натр едкий, 0,3 моль/л: готовят, растворяя 1,2 г NaOH в 100 мл воды, концентрацию проверяют титрованием (она должна быть 0,3 н).

4. Ортотолуидин, 1%-ный раствор: 1 г препарата растворяют в 100 мл абсолютного спирта. Раствор можно хранить в холодиль­нике в склянке с притертой пробкой несколько месяцев. Имею­щийся в продаже препарат можно очистить перекристаллизацией, для чего его растворяют в абсолютном спирте, добавляют воду и выпавшие кристаллы отсасывают на фильтре, затем сушат над хлоридом кальция.

5. Ацетатный буферный раствор рН 4,8: смешивают 4 части 0,25 н уксусной кислоты (проверить титрованием) и 6 частей 0,25 н ацетата натрия (содержит 34 г CH3COONa X ЗН2О в 1 литре).

6. Глюкозооксидаза — сухой препарат активностью 3000 ед/мг или больше.

7. Пероксидаза из хрена. 1 мг растворяют в 5 мл ацетатного буфера, в холодильнике можно хранить не­сколько дней.

8. Рабочий реактив: в 80 мл ацетатного буфера растворяют 2 мг глюкозооксидазы и 1 мг пероксидазы, прибавляют 1 мл 1%-ного раствора ортотолуидина, перемешивают и доводят объем буферным раствором до 100 мл. Рабочий реактив должен быть прозрачным, бесцветным или иметь слабо-зеленый оттенок, в этом случае он устойчив при хранении на холоде. Если же окраска интенсивна или через несколько часов после приготовления начи­нает выпадать осадок, это значит, что ортотолуидин недостаточ­но чистый и его надо перекристаллизовать.

9. Калибровочные растворы глюкозы. Глюкозу предваритель­но высушивают при температуре 37°С и хранят в эксикаторе. Сначала готовят основной раствор с концентрацией 50 ммоль/л, для чего 180 мг вещества растворяют в 20 мл насыщенного раство­ра (примерно 0,3%-ного) бензойной кислоты. Из этого раствора готовят рабочие калибровочные растворы, содержащие 3; 6; 9; 12; 15; 18 и 21 ммоль/л, для чего берут 0,6; 1,2; 1,8; 2,4; 3; 3,6 и 4,2 мл основного раствора и доводят насыщенным раствором бензойной кислоты до объема 10 мл. Эти растворы содержат глюкозу в тех же концентрациях, в которых она бывает в крови, что облегчает расчеты при калибровке.

Реактивы для исследования

Для определения сахара наиболее удобно использовать экспресс-методы определения глюкозы в крови. Это объясняется простотой в использовании и быстрым получением результата. Кроме этого, больному не нужно идти в лабораторию или больницу. Но в отличие от глюкозооксидазного теста такая диагностика является недостоверной. Так как не дифференцирует глюкозу от других сахаров и определяет их концентрацию вместе. real6.ch

Основу глюкозооксидазной реакции составляет натрия хлорид 9% раствор и цинка сульфат 50%. Их добавляют на стадии центрифугирования крови. Кроме этого, используют буферный раствор с уксусной кислотой и ацетатом натрия. Методом титрования определяют его рН на уровне 4,8. После, добавляется глюкозооксидаза, из-за чего выделяется перекись водорода и пероксидаза, участвующая в окрашивании раствора до нужной концентрации для получения точного результата.

Вернуться к оглавлению

Суть глюкозооксидазного метода определения глюкозы

Оценка результата происходит с помощью количественного метода фотометрии через один и тот же промежуток времени. Обязательно использование калибровочного раствора, который содержит определенную заявленную норму сахара и, отталкиваясь от нее, можно судить о концентрации глюкозы в выделяемых жидкостях организма, чаще в крови.

Вернуться к оглавлению

Что в основе этого способа?

Существуют различные методы определения концентрации глюкозы в крови, но глюкозооксидазный является наиболее точным. Подоснова его состоит в том, что при взаимодействии сахара с кислородом воздуха происходит окисление реагента. В раствор выделяется перекись водорода. Это вещество взаимодействует с ортотолуидином, образуя окрашенное соединение. Для поведения этой реакции необходимо присутствие специальных ферментов. При реакции окисления должна присутствовать глюкозооксидаза, а при окрашивании жидкости — пероксидаза. Интенсивность окраски раствора будет зависеть от содержания глюкозы и быть более всего интенсивной при высоком ее содержании.

Источник

Глюкозооксидаза

Глюкозооксидаза (пищевая добавка Е1102) — фермент, окисляющий β-D-глюкозу до глюконо-1,5-лактона, который спонтанно гидролизуется до глюконовой кислоты. При этом образуется пероксид водорода. Внешне выглядит как белый или желтоватый порошок, водные растворы от жёлтого до коричневого цвета. Оптимум действия pH 5–6; соли ртути и серебра являются сильными ингибиторами фермента. Растворим в воде; практически нерастворим в этаноле, хлороформе, эфире.

Пищевая добавка Е1102 относится к улучшителям муки и хлеба, антиокислителям и антиоксидантам синтетического происхождения, используется в технологических целях в процессе производства пищевых продуктов.

Структура

Глюкозооксидаза — это димерный белок, который содержит в качестве кофактора флавинадениндинуклеотид (ФАД), распространённый компонент окислительно-восстановительных реакций.

Фермент имеет эллиптическую форму. Состоит из 580 остатков аминокислот, ФАД-кофактор, шесть N-ацетилглюкозаминных остатков и три остатка маннозы. Размеры молекулы: 6,0 нм × 5,2 нм × 7,7 нм.

Природный источник

Продуцируется грибами Aspergillus niger var. и некоторыми штаммами Penicillium.

Получение

Контролируемой ферментацией грибов Aspergillus niger var.

Метаболизм и токсичность

Доказательства того, что какие-либо ферменты, используемые в пищевых технологиях, вредны сами по себе, отсутствуют, тем более что в большинстве случаев ферменты в процессе обработки инактивируются. Однако остаётся возможность образования токсинов во время роста микроорганизмов, используемых для биосинтеза ферментов. Гарантировать отсутствие микотоксинов и патогенных микроорганизмов должен изготовитель препарата.

Применение

Поскольку в результате действия глюкозооксидазы образуется перекись водорода, фермент обычно используется в смеси с каталазой (в соотношении 1:1 по активности), разрушающей перекись. Глюкозооксидаза удаляет как кислород, так и глюкозу, поэтому она широко используется при обработке тех пищевых продуктов, вкус, окраска и аромат которых ухудшаются в результате окислительных процессов. Часто при высушивании продуктов питания глюкоза вступает в реакцию меланоидинообразования с белками или продуктами их расщепления, что вызывает нежелательное изменение окраски. Обработка такого продукта глюкозооксидазой предотвращает этот процесс. Наличие глюкозы в яйцах приводит к тому, что при хранении жидких и сухих яичных продуктов белок темнеет, приобретает неприятный вкус и запах, а белок яичного порошка теряет способность к растворению. Для удаления глюкозы в яичную массу вносят препарат глюкозооксидазы.

Глюкозооксидаза совместно с каталазой выполняют роль синергистов антиоксидантов, способствуя удалению следов кислорода из вина, пива, топлёного и свежего свиного и говяжьего жира, сливочного масла, колбасных изделий, сгущённого и сухого молока, маргарина, продуктов переработки фруктов. Используемые количества 0,0001–0,0002 %.

Внесение глюкозооксидазы в тесто при замесе в количестве до 0,00005 % вызывает окисление свободных сульфгидрильных групп в структуре клейковинных белков, посредством чего образуются дисульфидные связи, способствующие укреплению клейковины, увеличению эластичности теста и объёма изделий. Глюкозооксидаза инактивируется в процессе выпечки.

Другие сферы применения: глюкозооксидаза может переносить электроны не только на кислород, но и на металлы, поэтому этот фермент широко используется в биосенсорах для измерения уровня глюкозы. Такие биосенсоры составляют центральную часть приборов, определяющих уровень сахара, например, в крови у больных диабетом.

Товарные формы

Белый или желтоватый порошок, водные растворы от жёлтого до коричневого цвета, в смеси с каталазой в соотношении 1:1 по активности.

Беременность и грудное вскармливание

Применение при беременности

Адекватных и хорошо контролируемых исследований о возможности применения глюкозооксидазы у беременных женщин не проведено. Неизвестно, оказывает ли вещество немедленное или отсроченное неблагоприятное воздействие на плод.

Применение в период грудного вскармливания

Специальных исследований о возможности применения глюкозооксидазы в период грудного вскармливания не проведено.

Особые указания

Пищевая добавка Е1102 не входит в перечень разрешённых к применению в пищевой промышленности в Российской Федерации, Европейском Союзе. Разрешена в Австралии, Новой Зеландии и на Украине.

Источник

Современные методы определения глюкозы

Герасименко В.А., к.м.н., Куриляк О.А., к.б.н.

Из архива газеты «Новости А/О Юнимед»

Определение концентрации глюкозы в крови – одно из наиболее часто выполняемых биохимических исследований в КДЛ. Причина исключительной популярности теста связана с высокой заболеваемостью сахарным диабетом. Данный тест выполняется как в условиях стационара, так и в поликлиниках. Больные сахарным диабетом вынуждены исследовать уровень глюкозы в крови в домашних условиях, поскольку без этой информации им трудно скорректировать свою диету, физические нагрузки, применение инсулина и других сахароснижающих препаратов. Исключительная важность теста и большие объемы выполняемых исследований стимулировали разработчиков к созданию различных типов приборов и методов определения концентрации глюкозы в крови.

В настоящее время существует достаточно много методов определения глюкозы. Их можно классифицировать следующим образом.

Методы определения глюкозы в сыворотке крови

— фотометрический по конечной точке

— отражательная фотометрия – сухая химия

Первые два метода крайне неудобны, токсичны и обладают низкой точностью, поэтому мы на них не будем останавливаться.

Глюкозооксидазный метод

Сегодня наибольшее распространение получили методы, основанные на использовании фермента – глюкозооксидазы. В основе метода лежит следующая реакция:

Глюкозооксидаза катализирует перенос двух водородных атомов с первого углеродного атома глюкозы на кислород, растворенный в жидком реагенте. При этом в ходе реакции образуется в эквимолярных количествах перекись водорода. Т.е. концентрация образовавшейся перекиси водорода точно равна определяемой концентрации глюкозы. Следовательно, использование глюкозооксидазной реакции, трансформировало задачу определения концентрации глюкозы в задачу определения концентрации перекиси водорода, которая, как будет показано ниже, значительно проще первой. И здесь есть несколько способов, широко используемых сегодня в лабораторной практике (см. схему).

На рис. 1 и 2 показаны спектры рабочего раствора до внесения в него стандартного раствора глюкозы и после. Максимум поглощения реакционной смеси – (реактив + глюкоза) находится в области 500 нм. Соответственно, изменение оптической плотности конечной реакции на длине волны 480-520 нм пропорционально концентрации глюкозы, содержащейся в пробе.

Рисунок 1. Спектр рабочего раствора

Рисунок 2. Спектр реакционной смеси (рабочий раствор + глюкоза)

Большая популярность данного метода определения глюкозы объясняется его высокой специфичностью и простотой выполнения. Метод можно реализовать как с применением обычного фотометра (лучше специализированного биохимического фотометра типа Микролаб 540), так и с помощью автоматических биохимических автоанализаторов.

Наряду с методом фотометрирования по конечной точке, несколько лет назад появились наборы, в которых реализован кинетический метод фотометрирования. Суть метода состоит в том, что при определенном соотношении активностей глюкозооксидазы и пероксидазы, скорость образования окрашенного соединения некоторое время после внесения пробы в рабочий раствор будет пропорциональна концентрации глюкозы в пробе. Преимущество такого метода состоит в том, что результат не зависит от наличия в пробе других соединений, поскольку поглощение последних стабильно во времени. Этот метод требует применения кинетического фотометра, например Stat Fax 1904+, Stat Fax 3300, полуавтоматических анализаторов, например Clima 15, или автоматических биохимических анализаторов. Измерение концентрации глюкозы из цельной крови удобно выполнять с помощью приборов, работа которых основана на амперометрическом принципе измерения, при помощи специальных ферментных датчиков. Перекись водорода является крайне нестабильным химическим соединением и она может служить источником заряженных частиц. Именно это и используется в ферментных датчиках мембранного типа или электрохимических элементах портативных глюкометров.

Рисунок 3. Измерительная ячейка

В измерительной ячейке, сконструированной как проточная, находится измерительная камера, с одной стороны ограниченная ферментной мембраной (Рис. 3). На мембрану толщиной около 60 микрон специальным образом сорбирована глюкозооксидаза. С другой стороны мембраны к ней прижимается платиновый электрод.

Проба цельной крови (обычно 20 мкл) разводится в системном буферном растворе (эритроциты разрушаются), после чего подается по магистрали в проточную ячейку. Глюкоза, подвергается окислению под воздействием фермента глюкозооксидазы, находящейся на мембране. Образовавшаяся перекись водорода диффундирует через мембрану и окисляется далее в каталитической реакции под действием платины. Диффузия перекиси водорода на поверхность платины формирует ток, пропорциональный числу молекул Н₂О₂. Полученный таким образом сигнал обрабатывается прибором в соответствующее значение напряжения. Это измеренное значение пропорционально концентрации глюкозы в пробы.

В качестве примера приборов, использующих вышеописанный метод можно назвать автоматические анализаторы глюкозы Biosen (Германия). Эти приборы удобны для использования не только в стационарах, но и в поликлиниках, где анализ на глюкозу делают преимущественно из капиллярной крови.

Важным этапом в развитии методов клинической лабораторной диагностики стало появление «сухой химии». Естественно, одним из первых приложений этой технологии стала задача определения глюкозы в крови пациента. Первые приборы значительно уступали по точности традицинным лабораторным методам исследований. Однако, со временем, ряду фирм удалось разработать такие диагностические полоски и отражательные фотометры, которые обеспечили весьма высокую точность анализа. Широко популярными во всем мире в настоящее являются глюкометры One Touch и тест-полоски к ним производства компании Life Scan (США), которые удачно сочетают в себе аналитическую точность количественного ферментативного метода со скоростью и простотой «сухой химии».

Глюкометры One Touch предназначены для быстрого и точного измерения уровня глюкозы в цельной крови. Тест-полоска One Touch содержит все необходимые химические компоненты для двухэтапного глюкозооксидазного метода, включая ферменты глюкозооксидазу и пероксидазу, которые сорбированы на уникальную пористую гидрофильную мембрану. Результатом реакции является образование окрашенного комплекса. Интенсивность развившейся окраски регистрируется отражательным минифотометром.

Рисунок 4. Конструкция тест-полоски

В дополнении к этому, мембрана обладает гидрофильными свойствами, благодаря которым капля крови “притягивается” к поверхности тест-полоски при касании.Мембрана тест-полоск One Touch напоминает губку с микроскопическими порами и выполняет тройственную функцию. Она действует: 1) как резервуар, собирая необходимое количество крови, 2) как фильтр, блокируя твердый клеточный материал (эритроциты, лейкоциты и др.), 3) как гладкая оптическая поверхность, на которой измеряется отраженный свет. Последняя функция, в частности, очень важна для работы прибора. Она делает возможным считывать нижнюю часть полоски, тогда как кровь остается на верхней части тест-полоски. Соответственно, нет необходимости стирать (промокать) кровь с поверхности тест-полоски.

В состав приборов One Touch входит два специальных светодиода. Обработка развившейся окраски на тест-полоске идет следующим образом. Как только тест-полоска вставлена в прибор – происходит нулевое считывание. В этот момент на дисплее мы видим: “ЖДАТЬ”. Когда капля крови наносится на тест-полоску, плазма крови моментально сорбируется мембраной, тогда как эритроциты и излишки плазмы остаются на поверхности мембраны. После полного впитывания капли крови немедленно происходит окрашивание. Прибор регистрирует изменение величины отражения и автоматически запускает таймер. Через 45 секунд химическая реакция заканчивается, результат светоотражения обрабатывается. Окрашенный продукт реакции поглощает свет, испускаемый первым светодиодом. Форменные элементы крови и лишняя плазма также поглощают свет, излучаемый диодом. Чтобы скорректировать фоновое отражение, второе считывание производится вторым светодиодом на другой длине волны. Разность сигналов от первого и второго светодиода несет информацию о поглощении света хромогеном. Сигнал, полученный от хромогена для оценки концентрации глюкозы, соотносится со специальной калибровкой. Все приборы One Touch откалиброваны с использованием референтного метода на лабораторном анализаторе глюкозы. С помощью этой процедуры получается стандартная калибровочная кривая. Отметим, что достаточно сложно наладить производство тест-полосок, которые были бы абсолютно одинаковыми химически, в силу очень низкой концентрации реактивов. Для решения этой проблемы используется стандартная калибровочная кривая, состоящая из 16 –ти калибровочных линий. Контроль качества осуществляется сразу после производства тест-полосок, что позволяет определить, какая из калибровочных линий (от 1 до 16) может быть применена для данной тест-полоски. Это так называемый номер кода, который проставляется на упаковке тест-полосок. Эти 16 калибровочных линий также программируются в микропроцессоре прибора. Для получения оптимально точных результатов, номер кода, указанный на упаковке тест-полосок выставляется в приборе при помощи кнопки кода. Таким образом, неправильно установленный код на приборе может являться причиной ошибки измерения.

С момента появления на рынке приборов One Touch прошло большое количество клинических исследований в лабораториях России, Америки и Европы. Одно из таких исследований было проведено Эндокринологическим научным центром РАМН по заказу Российской Ассоциации Медицинской Лабораторной Диагностики. Специалисты Центра провели сравнительный анализ двух методов измерения уровня глюкозы в крови. Результаты, полученные на One Touch, сопоставлялась с данными, полученными на биохимическом анализаторе Spectrum II (Abbott Laboratories, США), реализующем гексокиназный метод определения глюкозы. Было исследовано 190 проб крови от 95 пациентов. Коэффициент корреляции результатов составил 0,98641. Коэффициент вариации в нормальном и патологическом диапазонах на глюкометре One Touch не превысил 2,5%.

Рис. 5. Корреляционная зависимость показаний “One Touch” и «Спектрум-2» (коэффициент корреляции 0,98641)

В заключении следует упомянуть и о недостатках глюкозооксидазного метода. Образующаяся перекись водорода и супероксид анион-радикал могут окислять не только хромоген, но и другие вещества, присутствующие в биологической жидкости: аскорбиновую кислоту, мочевую кислоту, билирубин. При этом, соответственно, доля перекиси, принимающая участие в окислении хромогена, снижается, что приводит к занижению результата по глюкозе. Этот метод линеен, как правило, до 20-30 ммоль/л глюкозы.В официальном отчете Эндокринологического научного центра РАМН сказано: «приборы One Touch обладают высокой точностью и правильностью, а также широким диапазоном измерений. Их можно использовать для диагностики неотложных состояний при диабете, в том числе бригадами “Скорой помощи”, поскольку эти приборы не только надежны, но и быстро дают результаты».

Гексокиназный метод

Регистрация осуществляется при длине волны 340 нм по светопоглощению НАДН. Этот метод является высокоспецифичным и не дает реакции с другими компонентами сыворотки крови. Гексокиназный метод считается референтным для определения глюкозы. Как правило, он линеен до 50 ммоль/л, что позволило его широко рекомендовать для клиник с эндокринологическими отделениями.

Из описанного разнообразия методов определения глюкозы сотрудники КДЛ могут решить для себя, какой способ определения и какой прибор выбрать:

Т.о., задача КДЛ обеспечить не только быстрое, но и высокоточное определение глюкозы, на сегодняшний день вполне решаема.

Источник