Интрон и экзон что это
Интрон и экзон что это
Генетические ресурсы важны для поддержания мирового производства пшеницы как в настоящий момент, так и в будущем. Это понятие включает широкий диапазон генетического разнообразия, необходимого для усиления потенциала урожайности пшеницы. Генетические ресурсы открывают доступ к новым источникам устойчивости и толерантности к биотическим и абиотическим стрессам.
Современные высокоурожайные сорта пшеницы представляют собой сочетания генов или генных комбинаций, собранных селекционерами, использующими, в большинстве случаев, хорошо приспособленные сорта собственных регионов. Международные исследования в аграрной сфере значительно расширили доступность высокоадаптивных генетически разнообразных ресурсов для селекции мягкой пшеницы. Интрогрессия дополнительной вариации, обнаруженной в генетических ресурсах, необходима для увеличения стабильности получаемого урожая и дальнейшего улучшения пшеницы.
Целью нашей работы было прямое клонирование и сравнительный анализ области В3 домена гена Viviparous1 у Th. intermedium и Th. ponticum.
Материалы и методы
В работе использовали образец Th. intermedium PI 547312 и Th. ponticum PI 401200 (полученные из Germplasm Research International Network).
ДНК выделяли из молодых листьев и корешков по методу Bernatzky и Tanksley [12].
ПЦР, клонирование, секвенирование
Результаты и обсуждение
При проведении ПЦР с праймерами VP-1BB4F и VP-1BB4R, комплементарными к шестому экзону и пятому интрону гена Viviparous1 у субгенома В мягкой пшеницы на всех исследуемых образцах Th. intermedium и Th. ponticum были получены продукты амплификации различного размера. Нами были клонированы и секвенированы все ПЦР-продукты, амплифицируемые на видах Th. intermedium и Th. ponticum.
Для образцов Th. intermedium были получены различные сиквенсы, которые укладывались в три варианта, поэтому мы посчитали целесообразным выделить у Th. intermedium три аллельных варианта этого участка гена Viviparous1 (рис. 1). Как видно на рисунке 1, полученные нами сиквенсы на Th. intermedium в основном различаются в своей неинформативной интронной части, а в участке нуклеотидной последовательности, относящейся к экзону, больших различий не наблюдается, кроме одно-нуклеотидные замены. Подобная картина наблюдалась и в предыдущей нашей работе по анализу гена Viviparous1 у видов Thinopyrum elongatum, Thinopyrum bessarabicum, Pseudoroegneria stripifolia, Dasypyrum villosum [13]. При этом следует отметить, что именно полиморфизм в этой области интрона у белозерных пшениц вызывает различия в устойчивости к прорастанию на корню [11]. Это связывают с альтернативным сплайсингом при наличии определенного полиморфизма в интронах. Таким образом, на функционирование гена Viviparous1 оказывает влияние не только информация, закодированная в экзонах, но и наблюдающийся полиморфизм в интронах.
Рис. 1. Выравнивание трех аллельных вариантов участка гена Viviparous1, выявленных у аллелей Thinopyrum intermedium. Цветом обозначен конец интрона (красный) и начало экзона (синий)
Для образцов Th. ponticum были получены различные сиквенсы, которые укладывались в четыре варианта нуклеотидных последовательностей различных аллелей (рис. 2). При этом следует отметить, что в отличие от сиквенсов, полученных нами на видах Th. intermedium, Th. elongatum, Th. bessarabicum, Pseudoroegneria stipifolia, Dasypyrum villosum, у Th. ponticum наблюдалось достаточно существенное разнообразие в области шестого экзона (рис. 2). Так, у последовательности Th. pont1 в районе экзона имеется вставка размером 427 п.н. Таким образом, можно предположить, что функционирование данного аллеля может существенно отличаться от функционирования аллелей гена Viviparous1, известных к настоящему времени.
Рис. 2. Выравнивание четырех аллельных вариантов участка гена Viviparous1, выявленных у аллелей Thinopyrum ponticum. Цветом обозначен конец интрона (красный) и начало экзона (синий)
При построении филогенетических деревьев с участием полученных в нашей работе сиквенсов мы установили, что все они попадают в один кластер с последовательностями к виду мягкой пшеницы Triticum aestivum (рис. 3). Cиквенсы генов-гомологов Vp1 мягкой пшеницы различных субгеномов оказались в различных кластерах, в то время как сиквенсы пырея среднего и пырея понтийского были объединены в один кластер. Полученные нами результаты согласуются с данными Cai и Jones [14], в соответствии с которыми субгеномы пырея понтийского и среднего J, S и J s ближе друг к другу, чем субгеномы мягкой пшеницы A, B и D. На себя обращает внимание кластеризация выявленных нами последовательностей пырея понтийского и пырея удлиненного с опубликованной последовательностью Triticum aestivum vp1D, которая относится к D-субгеному мягкой пшеницы, что согласуется с данными о близости D-субгенома и субгеномов St и J пырея [15]. Таким образом, полученные нами результаты способствуют установлению филогенетических и эволюционных связей между различными видами пырея и мягкой пшеницы.
Рис. 3. Кластеризация полученных нами сиквенсов участка гена Viviparous1 с известными сиквенсами злаковых культур
Клонированные и охарактеризованные нами последовательности ДНК могут служить отправной точкой для клонирования полноразмерных генов-ортологов у изучаемых видов. Как известно, одним из способов повышения устойчивости к прорастанию на корню может быть внедрение в геном мягкой пшеницы генов Vp1 из различных видов злаков при межвидовой и отдаленной гибридизации. Благодаря высокой скрещиваемости наиболее привлекательными для этой цели являются различные виды пырея.
Таким образом, полученные нами нуклеотидные последовательности смогут послужить для создания молекулярных маркеров для оценки влияния различных генов Viviparous1 пырейного происхождения на прорастание семян злаковых, а в дальнейшем и для интрогрессии их в геном пшеницы.
Выводы
Работа выполнена при финансовой поддержке Федерального агентства по образованию в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России», государственный контракт П598 от 06 августа 2009 г. «Конструирование ДНК-библиотеки генов гомологов гена Vp-1 (viviparous) злаковых культур и её характеристика». Работа была выполнена с использованием оборудования ЦКП «ВНИИСБ»
Рецензенты:
Работа получена 30.08.2011
Разница между интронами и экзонами
Интроны и экзоны считаются двумя признаками гена, содержащего кодирующие области, известные как экзоны, которые прерываются некодирующими областями, известными как интроны. Экзоны кодируют белки, а о
Содержание:
Интроны и экзоны считаются двумя признаками гена, содержащего кодирующие области, известные как экзоны, которые прерываются некодирующими областями, известными как интроны. Экзоны кодируют белки, а области ДНК между экзонами являются интронами. Только эукариоты содержат интроны в кодирующей области. У эукариот и интроны, и экзоны транскрибируются в первичную транскрипт мРНК. Во время процессинга мРНК интроны удаляются из первичного транскрипта мРНК, образуя зрелую мРНК, которая покидает ядро в цитоплазме, чтобы транслироваться в аминокислотную последовательность. главное отличие между интронами и экзонами в том, что интроны остаются внутри ядра, сохраняя ДНК в генах, тогда как экзоны покидают ядро, чтобы быть переведенными в белок.
Эта статья исследует,
1. Что такое интроны
— определение, характеристики, функции
2. Что такое экзоны
— определение, характеристики, функции
3. В чем разница между интронами и экзонами
Что такое интроны
Рисунок 1: Пре-мРНК и ее сплайсинг в зрелую мРНК
Интроны можно разделить на четыре основных класса: сплайсосомные интроны, интроны тРНК, интроны группы I и интроны группы II. Сплайсосомные интроны обнаруживаются в белках, кодирующих гены, которые удаляются сплайсосомами. Интроны тРНК представляют собой сегменты тРНК, удаленные из антикодонной петли предшественников тРНК. Интроны группы I и группы II самосращиваются из широкого спектра кодирующих белок и других типов мРНК, образуя трехмерную архитектуру.
Биологическая функция интронов точно не известна. Интроны в геноме служат существенной частью ДНК, обеспечивая безопасность ДНК в геноме. Альтернативный сплайсинг интронов способствует выработке широкого спектра белков из одного первичного транскрипта мРНК.
Что такое экзоны
Рисунок 2: Структура гена с экзонами и интронами
Разница между интронами и экзонами
Определение
интроны: Интроны представляют собой сегменты ДНК, которые не кодируют какую-либо аминокислотную последовательность в кодирующей области.
экзоны: Экзоны представляют собой сегменты ДНК, которые кодируют часть аминокислотной последовательности полного белка.
Кодирующая ДНК
интроны: Интроны принадлежат некодирующей ДНК.
экзоны: Экзоны принадлежат кодирующей ДНК.
транскрипция
интроны: Интроны рассматриваются как основания, расположенные между двумя экзонами.
экзоны: Экзоны являются основаниями, которые кодируют аминокислотную последовательность белка.
Присутствие
интроны: Интроны встречаются только у эукариот.
экзоны: Экзоны встречаются как у прокариот, так и у эукариот.
Движение в Ядре
интроны: Интроны остаются в ядре путем сплайсинга из первичного транскрипта мРНК во время процессинга мРНК внутри ядра.
экзоны: Экзоны покидают ядро в цитоплазме после продуцирования зрелой мРНК.
Сохранение последовательности
интроны: Последовательности в интронах менее консервативны по сравнению с экзонами.
экзоны: Последовательности в экзонах высоко консервативны.
Присутствие в геноме
интроны: Интроны обнаруживаются в первичном транскрипте ДНК и мРНК.
экзоны: Экзоны обнаруживаются как в ДНК, так и в мРНК.
функция
интроны: Функция интронов неизвестна, но считается, что она представляет собой значительную часть ДНК.
экзоны: Функция экзонов должна быть переведена в белок.
Заключение
Ген представляет собой сегмент ДНК, который дает функциональный продукт, полипептид или РНК. Межгенные области гена состоят из интронов. Это означает, что ген у эукариот состоит из структуры кодирующей области, которая разделена на сегменты, называемые экзонами; Интроны могут быть найдены между двумя экзонами. Интроны принадлежат некодирующей ДНК. Все экзоны вместе с межгенными областями транскрибируются РНК-полимеразой в основной транскрипт мРНК. Интроны удаляются из первичного транскрипта во время процессинга мРНК. Таким образом, зрелая мРНК состоит только из экзонов. Сплайсинг экзонов может происходить альтернативным образом в полицистронных мРНК у прокариот, продуцируя более одного типа зрелых мРНК из одного первичного транскрипта мРНК. Интроны в геноме считаются существенной частью ДНК, тогда как экзоны кодируют белки. Следовательно, основное различие между интронами и экзонами заключается в их функции в геноме.
Глава вторая. Строение эукариотических генов
2.1. Экзоны и интроны
Открытие прерывистой структуры гена 47. Прерывистая структура эукариотических генов и явлений сплайсинга были открыты при детальном изучении структуры генома аденовируса 2, одного из вирусов, содержащих ДНК.
Две группы в лаборатории Колд-Спринг-Харбор (США) изучали структуру поздних мРНК аденовируса и неожиданно обнаружили, что все они начинаются с одной и той же короткой последовательности, т. е. 5′-конец у всех пяти мРНК был одинаковым (см рис. 4). Далее оказалось, что эта последовательность не соседствует с поздними генами, а выявляется в левой части аденовирусного генома на значительном расстоянии от них. Более того, эта «лидерная последовательность» гибридизовалась с тремя разными участками левой половины генома. Особенно четко такая структура мРНК выявляется при изучении гибридов между мРНК и ДНК аденовируса в электронном микроскопе. На электронных микрофотографиях отчетливо видно, что каждая поздняя мРНК аденовируса образует гибриды с четырьмя разными участками аденовирусного генома: тремя короткими, расположенными в его левой части, и одним длинным (собственно геном). В то же время появились данные, что главным первичным продуктом транскрипции аденовирусного генома на поздних стадиях инфекции является длинная РНК, считываемая почти со всей L-цепи.
Учитывая все это, единственным объяснением странной структуры аденовирусных мРНК являлось допущение, что вначале идет непрерывная транскрипция генома, образуется длинный предшественник мРНК (про-мРНК), затем из этой про-мРНК вырезаются внутренние участки, а образовавшиеся концы соединяются, связываются (см. рис. 4).
В 1977 г. этот вывод казался совершенно парадоксальным, не вытекающим из каких-либо теоретических предпосылок. Однако эксперимент был настолько ясен, что он был безоговорочно принят на симпозиуме 1977 г. в Колд-Спринг-Харбор, посвященном хроматину. Стало ясным, что по крайней мере гены аденовируса складываются из нескольких несоседствующих блоков, названных позднее экзонами. Экзоны, в свою очередь, разделены блоками ДНК, не выявляемыми в зрелой мРНК. Последние были названы нитронами.
Новообразующаяся про-мРНК считывается непрерывно и поэтому содержит в своем составе и экзоны и интроны. Затем интроны вырезаются из про-мРНК, а концы экзонов соединяются. Это явление получило название сплайсинга.
Дальнейшее изучение транскрипции и сплайсинга поздних генов аденовируса позволило уточнить детали этого процесса. Транскрипция всегда начинается с первого экзона и кончается после прохождения РНК-полимеразы почти вдоль всего генома аденовируса. Затем в про-мРНК вносится разрыв сразу после одного из пяти генов, что и определяет судьбу про-мРНК. При сплайсинге удаляются интроны между 1-м и 2-м лидерами, между 2-м и 3-м лидерами и, наконец, весь отрезок про-мРНК между 3-м лидером и началом последнего экзона. Если, скажем, цепь оборвалась после третьего экзона, то экзоны, соответствующие двум первым генам, удаляются, т. е. в этом случае они являются частью большого третьего интрона (см. рис. 4).
Первые результаты были получены на генах β-глобина мыши и овальбумина кур. Оказалось, что фрагменты генома, с которыми гибридизуется мРНК соответствующих генов, в своей сумме намного превышают по размерам длину мРНК. Наиболее информативны данные по сравнению структуры геномного клона, содержащего данный ген, и кДНК-клона, т. е. клона, ДНК которого считана ревертазой с мРНК. В этом случае прямо сравнивается структура гена и мРНК.
Размер интронов иногда составляет всего несколько десятков пар нуклеотидов, а иногда, например в случае ряда генов дрозофилы (D. melanogaster), достигает нескольких десятков тысяч пар нуклеотидов.
Рассмотрим некоторые особенности строения интронов. Одной из характерных черт является консервативность локализации интронов в родственных генах одного вида или в одинаковых генах разных видов. В то же время нуклеотидная последовательность самих интронов мало консервативна и подвергается быстрым изменениям в эволюции. Поэтому интроны, расположенные в одних и тех же местах родственных генов, могут сильно различаться по нуклеотидным последовательностям. Они, во всяком случае, гораздо менее консервативны, чем экзоны.
Теперь мы рассмотрим более подробно экзон-интронную структуру двух генов, клонирование которых было осуществлено в нашей лаборатории.
Так как, по расчетам, мРНК для белка р53 должна была составлять не более 0,01 % от всей мРНК, то тотальную мРНК клеток опухоли SVT2 мыши вначале обогащали по р53-мРНК. Для этого выделяли из клеток мРНК, ультрацентрифугировали ее в сахарозном градиенте, собирали фракции РНК и вели на каждой из них синтез белка in vitro, добавляя в смесь меченую аминокислоту, метионин-[35S]. Из инкубационной смеси осаждали белки антителами к р53 и после электрофореза определяли появление меченого белка, имеющего ту же подвижность, что и р53. Фракции, которые содержали мРНК, обеспечивающие синтез р53, собирали и использовали для синтеза на них комплементарной ДНК (кДНК) с помощью фермента ревертазы (см. разд. 1.7). Синтезированную двухцепочечную ДНК встраивали в плазмиду и клонировали. Затем проводили поиск колоний, содержащих ДНК гена р53. С этой целью из клона выделяли ДНК и на эту ДНК вылавливали соответствующую ей мРНК путем гибридизации. Далее, на отловленной мРНК синтезировали меченый белок и определяли его природу с помощью антител к белку р53, как описано выше. Из примерно 100 проверенных таким образом клонов был получен один, содержащий ДНК, которая связывала мРНК для белка р53. Используя меченую ДНК полученного клона как зонд для гибридизации, вели поиск других клонов, содержащих другие части гена р53 мыши. Для этого вели гибридизацию меченой ДНК прямо с колониями бактерий, перенесенными и выращенными на фильтре (см. разд. 1.7). В результате было поймано еще несколько клонов и входящие в них вставки вместе перекрыли почти всю мРНК для гена р53. Так было осуществлено клонирование полной кДНК, или экзонной части гена р53. Вскоре после этого клонирование гена р53 было осуществлено и рядом других авторов.
Чтобы выделить геномный клон р53, использовали «библиотеки» клонированных фрагментов тотальной ДНК мыши или человека. ДНК фрагментировали рестриктазами и встраивали в бактериофаг X, которым затем заражали бактерии. Образовывалось множество бляшек. С ними гибридизовали ДНК ранее полученных клонов и таким образом находили колонии фагов, содержащие ген р53. В результате были изолированы полные геномные копии гена р53 мыши и человека. Сравнение между собою геномных и кДНК клонов позволяет выяснить экзон-интронную структуру гена. Такая работа была проделана почти одновременно в ряде лабораторий, в том числе в нашей В. Л. Бухманом и Н. Н. Нинкиной, которые анализировали ген р53 человека (рис. 6). Видно, что этот ген содержит 11 экзонов и 10 интронов.
18,3 т. п. н., из которых на экзоны приходится ∼2,6 т. п. н. В результате про-мРНК примерно в 7 раз длиннее, чем зрелая IMPHK. Интересно, что ген р53 мыши, хотя и отличается от человеческого по нуклеотидным последовательностям, особенно в интронах, имеет точно такую же организацию. В нем также некодирующий белок экзон отделен очень большим (6,3 т. п. н.) интроном от кластера из 10 кодирующих экзонов. Интроны располагаются в тех же самых местах, что и у гена мыши. Таким образом, общая структура гена весьма консервативна.
Рис. 6. Экзон-интронная структура онкогена р53 человека Экзоны даны широкой линией и буквой Э с номером экзона. Указан первичный транскрипт и зрелая мРНК (по результатам, полученным В. Л. Бухманом, О. П. Самариной и др.)
В ходе клонирования геномных копий было получено два варианта клонов, различающихся между собою по рестриктной карте. Они представляют собою два аллельных варианта гена р53, встречающихся в человеческой популяции. Оба варианта кодируют полноценный белок, хотя даже в аминокислотной последовательности белка имеются небольшие различия.
Клонирование гена и определение его структуры является обычно первым шагом по пути выяснения функционирования гена и регуляции его активности. В случае р53 использование клонированного гена позволило отчасти пробить свет и на функцию самого белка р53. Р. Вайнберг и ряд других ученых в США показали, что при введении этого гена в нормальные клетки и его последующей активной работе (синтезе мРНК и белка) клетки претерпевают ряд изменений, характерных для опухолевых клеток. Они становятся «бессмертными», т. е. приобретают свойство неограниченно размножаться при выращивании вне организма, в культуре клеток. На основе этих опытов ген р53 был отнесен к онкогенам, т. е. генам, изменения в которых могут вести к раковому превращению клеток.
Клонирование гена было осуществлено в нашей лаборатории Г. Н. Ениколоповым в сотрудничестве с Б. И. Кузиным (лаборатория Л. И. Корочкина). Стратегия клонирования была другая, чем в случае гена р53. Она базировалась на знании локализации гена в хромосомах и места экспрессии гена. Во-первых, как отмечалось выше, синтез эстеразы S идет исключительно в семявыносящих луковицах. Предварительные оценки показывали, что до 10 % всего вновь образующегося белка в этом органе составляет эстераза S. Можно было ожидать поэтому, что концентрация мРНК для эстеразы S в семявыносящих луковицах будет очень высокой (не менее 1 %) и поэтому хотя бы один клон из 100, гибридизующихся с мРНК (или синтезированной на ее матрице кДНК), будет содержать нужный ген.
Исходя из этого, вначале получали клоны, содержащие фрагменты геномной ДНК D. virilis. Далее, на мРНК из семявыносящих луковиц синтезировали с помощью ревертазы меченую ДНК и гибридизовали ее с колониями. Те колонии, ДНК которых активно связывала метку, наращивали, выделяли из них ДНК, метили ее и гибридизовали с препаратами политенных хромосом слюнных желез личинок D. virilis.
Однозначное доказательство было получено при инъекции ДНК клона в ядра овоцитов лягушки. Этот тест был впервые введен в практику М. Бирнстилом (Швейцария) для изучения регуляции транскрипции. Введенная в овоцит лягушки чужеродная ДНК становится там матрицей для синтеза мРНК, а на последней в цитоплазме овоцита активно синтезируется белок. Действительно, после введения ДНК клона в ядра овоцитов лягушки в последних начинался активный синтез эстеразы S дрозофилы, которую далее выявляли с помощью иммунологического теста.
Рис. 7. Экзон-интронная структура гена эргеразы S Drosophila virilis. Экзоныьаны жирной линией и обозначены буквой Э с номером (по результатам, полученным Г. Н. Ениколоповым и соавт.)
Имея геномный клон эстеразы S и соответствующую мРНК, Г. Н. Ениколопов сравнил их путем гибридизации мРНК с фрагментами ДНК и тем самым проанализировал экзон-интронную структуру гена, представленную на рис. 7. Из последнего видно, что ген состоит из двух экзонов, разделенных небольшим интроном. Вообще, обычно размеры интронов у насекомых меньше, чем у позвоночных.
С помощью клонированной последовательности была изучена транскрипция гена эстеразы S. Оказалось, что содержание мРНК для эстеразы S в клетках семявыносящих луковиц по крайней мере на три порядка выше, чем в других клетках дрозофилы. Те редкие транскрипты, которые (выявляются в других клетках, начинаются с точек, отличающихся от места старта главного транскрипта семявыносящих луковиц. Таким образом, только в дифференцированных клетках идет активная экспрессия гена эстеразы S.
Почему существуют интроны? 58. Открытие экзонов и интронов дало объяснение первому парадоксу организации генома у эукариот, а именно большим размерам единиц транскрипции, намного превышающим размеры собственно генов. Действительно, на интроны приходятся гораздо больше ДНК, чем на экзоны, и соответственно про-мРНК существенно длиннее, чем зрелая мРНК.
В то же время разорванная структура эукариотических генов была одной из крупнейших неожиданностей в молекулярной биологии. Она не вытекала из каких-либо априорных соображений, а просто явилась неумолимым выводом из результатов эксперимента. Однако, как только она стала совершившимся фактом, начались попытки осмысливания этого явления. Возник вопрос, зачем природе понадобилось вводить сложный процесс сплайсинга, включающего разрывы и соединения концов РНК и уничтожение трех четвертей синтезированной про-мРНК, вместо того чтобы просто иметь непрерывные гены, как в случае прокариотических организмов.
Остановлюсь на ряде высказанных в разное время гипотез. Прежде всего возникла идея, что сплайсинг с его способностью объединять разъединенные отрезки ДНК в один ген может играть важнейшую роль в эволюции, в частности в объединении разных генов в один и, следовательно, разных полипептидных цепей в одну. Тем самым сравнительно легко могут возникать новые гены. Эти представления находят подтверждение при сравнении экзон-интронной структуры некоторых генов и так называемой доменной структуры соответствующих им белков. Ряд белков состоит из нескольких доменов, т. е. блоков, разделенных структурно и функционально. Классическим примером является фермент ДНК-полимераза I. Хотя она и представлена одной непрерывной полипептидной цепочкой, но состоит фактически из двух разных ферментов: собственно ДНК-полимеразы (синтезирующей ДНК) и экзонуклеазы (разрушающей ДНК с конца). Эти два домена образуют две независимые компактные частицы, связанные между собою коротким полипептидным мостиком. Последний легко разрушается при мягкой обработке протеиназами, когда домены остаются неповрежденными в силу своей компактности. Это ведет к разделению доменов.
В эукариотических организмах белков, состоящих из нескольких доменов, очень много. Оказалось, что в тех случаях, когда в составе белка можно различить несколько доменов, то в гене на границе между отрезками, кодирующими соседние домены, как правило, присутствует интрон. Каждый домен, таким образом, представлен одним или несколькими экзонами. Можно допустить, что когда-то домены были разными генами, но затем в результате мутаций на их границах появились сигналы для сплайсинга и в результате произошло их объединение и создание нового гена. Ярким примером являются гены для мембранных белков рецепторов. У этих белков всегда есть по крайней мере четыре домена:
Эти домены в составе гена всегда разделены между собою нитронами.
Много примеров альтернативного сплайсинга получено на аденовирусе, где часто из одной и той же про-мРНК образуются по две, три или четыре разных мРНК, кодирующих разные белки (см. рис. 4). Существенно, что при альтернативном сплайсинге часто происходят изменения рамки считывания, т. е. одна и та же нуклеотидная последовательность дает разные аминокислотные последовательности. Для вирусов это особенно важно, так как позволяет более экономно использовать генетический материал, обеспечивает компактизацию генетической информации у вируса. Поскольку для клеточного генома ограничений по размеру не существует, то там явление альтернативного сплайсинга встречается реже и, как правило, рамка считывания сохраняется неизменной. Для многих генов вообще существует только один возможный вариант сплайсинга, и из одной про-мРНК образуется лишь один тип мРНК. Тем не менее и для генов эукариот можно найти много случаев альтернативного сплайсинга, при котором часто (по крайней мере, в случае вирусов) все варианты реализуются с определенной частотой, прежде всего в зависимости от последовательности нуклеотидов на границе экзона и интрона и от места положения сайта сплайсинга.
Использование того или иного типа сплайсинга не является объектом контроля. Однако в некоторых случаях реализуется и такая возможность. Например, у дрозофилы существует генетический элемент (называемый Р-элементом), кодирующий фермент транспозазу, который катализирует вырезание из генома и обратное встраивание в геном Р-элемента. Ген транспозазы состоит из четырех экзонов и трех интронов. При этом в большинстве клеток дрозофилы из про-мРНК вырезаются только два первых интрона, и полученная в результате мРНК не способна синтезировать транспозазу. Только в зародышевых клетках дрозофилы появляется некий дополнительный фактор, который обеспечивает вырезание третьего интрона. В результате только в этих клетках возникает активная транспозаза, что, в свою очередь, проявляется в вырезании из генома и встраивании в геном Р-элемента. В других клетках таких перемещений Р-элемента по геному выявить не удается.
Если искусственно с помощью генноинженерных методик удалить из гена транспозазы третий интрон и ввести такой Р-элемент в геном дрозофилы, то тогда он меняет свое поведение. Зрелая мРНК, кодирующая транспозазу, появляется во всех типах клеток, и в любых клетках организма становятся возможными перемещения Р-элемента.
Иными словами, на этой системе путем контроля процесса сплайсинга осуществляется регуляция активности гена.
Имеются и другие сходные примеры.
Нарушения экзон-интронной структуры и генетические болезни 2* [59, 60]. Хотя мутации внутри нитронов обычно проходят бесследно, мутации, затрагивающие границу между экзоном и интроном, могут иметь далеко идущие последствия. Огромный материал в этом отношении накоплен для мутаций в β-глобиновом гене, которые ведут к наследственной болезни β-талассемии. Разными исследовательскими группами проклонированы β-глобиновые гены из большого числа пациентов с β-талассемией, при которой нарушается адекватный синтез β-глобина. В тех случаях, когда грубых изменений в организации β-глобинового гена не наблюдалось, был проведен анализ первичной нуклеотидной последовательности. При этом оказалось, что часто при β-талассемии β-глобиновый ген имел единичные нуклеотидные замены как раз в области сочленений между экзонами и интронами. Это ведет к инактивации сайта сплайсинга, т. е. интрон перестает отсекаться от экзона в правильном месте. Обычно, однако, в нуклеотидной последовательности интрона находится другой участок, напоминающий по структуре сочленение. Этот участок и берет на себя функции сайта для сплайсинга. Их называют поэтому скрытыми сайтами сплайсинга. Однако при этом новая мРНК оказывается резко измененной и неспособной обеспечить синтез нормального β-глобина (рис. 9).
Бывают случаи, когда точечные мутации и внутри интрона порождают нарушения в сплайсинге. Это обычно связано с появлением в результате такой мутации последовательности, напоминающей усредненный сайт для сплайсинга. В настоящее время, начиная с классических работ Т. Маниатиса (США), описано много таких мутаций, характерных для талассемий из разных регионов.
При этом оказалось, что дополнительный сигнал, располагающийся в цепи РНК раньше, является значительно более активным, чем истинный сигнал. Поэтому у больного в процессе созревания β-глобиновой мРНК образуются два типа молекул. В 10 % случаев возникают нормальные мРНК- Большая же их часть (до 90 %) является дефектной и образуется за счет использования нового сигнала сплайсинга. Дефектные мРНК быстро разрушаются в клеточном ядре вскоре после своего синтеза. Таким образом, в цитоплазме эритроидных клеток больного имеются лишь нормальные (3-глобиновые мРНК, однако их количество снижено в 10 раз. У больного образуется в 10 раз меньше β-глобинового белка, что резко нарушает нормальную продукцию молекул гемоглобина в целом и приводит к развитию клинических признаков β-талассемии.
Следовательно, мутации, ведущие к нарушению сплайсинга, играют существенную роль в возникновении ряда наследственных болезней человека. Очевидно, что раз они так сильно меняют функциональную организацию гена, то им может принадлежать существенная роль и в процессах создания новых генов в ходе эволюции.