какие клетки поражает аденовирус при попадании в кровь
Публикации в СМИ
Инфекция аденовирусная
Заболевания, вызываемые вирусами семейства Adenoviridae, характеризуются высокой температурой тела, воспалением слизистых оболочек дыхательных путей и глаз, а также гиперплазией подслизистой оболочки и регионарных лимфатических узлов. Аденовирусная инфекция высоко контагиозна. Наиболее часто наблюдаемые разновидности • ОРВИ с выраженной лихорадкой (преимущественно страдают дети) • ОРВИ взрослых • Вирусные пневмонии • Острые аденовирусные ангины (развиваются у детей, особенно летом после купания) • Острые фолликулярные конъюнктивиты • Эпидемические кератоконъюнктивиты (преимущественно у взрослых) • Кишечные инфекции (энтериты), нередко осложняемые мезентериальными аденитами и инвагинациями. Частота. Очень часто регистрируемая инфекция, составляет 2–5% всех инфекций дыхательных путей. Чаще наблюдают у новорождённых и детей.
Этиология • Возбудители — ДНК-содержащие вирусы рода Mastadenovirus размером 60–90 нм; известно около 80 серотипов (сероваров) • Основные возбудители поражений человека •• Инфекции нижних отделов дыхательных путей (бронхиолиты, пневмонии) — серотипы 1, 2, 3, 5, 6, 7, 21 •• Фарингоконъюнктивиты — серотипы 1, 2, 3, 4, 6, 7, 14 •• ОРВИ — серотипы 3, 4, 7 •• Гастроэнтериты — серотипы 2, 3, 5, 40, 41 •• Конъюнктивиты — серотипы 2, 3, 5, 7, 8, 19, 21 •• Эпидемические кератоконъюнктивиты — серотипы 8, 19, 37 •• Геморрагические циститы — серотипы 11, 21 •• Менингоэнцефалиты — серотипы 2, 6, 7, 12, 32 •• Диссеминированные поражения — серотипы 5, 34, 35, 39 •• Цервициты и уретриты — серотип 37 •• Поражения, ассоциированные с целиакией, — серотип 12.
Эпидемиология. Аденовирусные инфекции человека широко распространены и составляют 5–10% всех вирусных заболеваний; большая часть поражений приходится на детский возраст (около 75%); при этом 35–40% регистрируют у детей до 5 лет, остальные — в возрасте до 14 лет. Основные пути передачи — воздушно-капельный и контактный.
Патоморфология • Варьирует для различных серотипов, при тяжёлой пневмонии можно выявить большое число внутриядерных включений • Возможен облитерирующий бронхиолит.
Клинические формы • Катар дыхательных путей • Фарингоконъюнктивальная лихорадка • Пленчатый конъюнктивит • Тонзиллофарингит (аденовирусная ангина) • Кишечная форма (вирусная диарея, гастроэнтерит) • Мезаденит • Вирусная пневмония.
Клиническая картина
• Катар дыхательных путей — самая распространённая форма, характеризующаяся выраженными катаральными изменениями со стороны дыхательных путей (ринофарингит, ларингит, трахеит, бронхит) при умеренных проявлениях общей интоксикации.
• Фарингоконъюнктивальная лихорадка. Характеризуется длительной температурной реакцией (до 2 нед при отсутствии интеркуррентных заболеваний и осложнений) и симптомами фарингита: боли в горле, редкий кашель, яркая гиперемия тканей зева с крупной «зернистостью» фолликулов слизистой оболочки; дыхательные пути в процесс вовлекаются в малой степени.
• Плёнчатый конъюнктивит. Обычно наблюдают у взрослых и детей старшего возраста. Односторонний (реже двусторонний) конъюнктивит с фибринозной плёнкой на поверхности слизистой оболочки (чаще нижнего века), сопровождающийся выраженным отёком окружающих тканей, болями, гиперемией и инъекцией сосудов конъюнктивы глаза, лихорадкой. Дыхательные пути в процесс не вовлекаются. Данная клиническая форма характерна только для аденовирусной инфекции (этиологически развёрнутый диагноз можно выставить без лабораторного подтверждения).
• Тонзиллофарингит. Типичен для детей дошкольного возраста. Характеризуется развитием воспалительных изменений тканей зева и нёбных миндалин с формированием ангины (катаральной, фибринозной, реже [при присоединении бактериальной инфекции] гнойной).
• Кишечная форма (гастроэнтерит, вирусная диарея). Характеризуется развитием умеренно выраженного гастроэнтерита, проявляющегося тошнотой, рвотой, жидким стулом без патологических примесей. Температурная тела субфебрильная. Возможно одновременное вовлечение в процесс органов дыхания (катаральный ринофарингит или ларинготрахеит).
• Мезаденит. Характеризуется развитием абдоминального синдрома с болями в животе и температурной реакцией. Иногда удаётся пальпировать увеличенные мезентериальные лимфатические узлы. В редких случаях возникает симптоматика «острого живота», имитирующая приступ острого аппендицита.
• Вирусная пневмония. Самостоятельная клиническая форма с типичной симптоматикой острой пневмонии (интоксикация, признаки лёгочно-сердечной недостаточности). Выражен экссудативный компонент (множественные разнокалиберные хрипы по всем лёгочным полям, кашель с обильной мокротой и т.п.). При рентгенографии выявляют распространённые воспалительные изменения со стороны лёгких. Данная клиническая форма не исключает возможного бактериального суперинфицирования, потому необходима противомикробная терапия.
Методы исследования • Выделение возбудителя инокуляцией в культуры эпителиальных клеток человека; исследуемый материал — отделяемое носа, зева, конъюнктивы, фекалии и др. • Выявление Аг вирусов в клетках иммунофлюоресцентной микроскопией, а также постановка РСК, реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и реакции нейтрализации цитопатического эффекта в культуре клеток • Рентгенодиагностика: бронхопневмония при тяжёлой респираторной инфекции • В тяжёлых или атипичных случаях — биопсия (лёгкого либо другой ткани).
ЛЕЧЕНИЕ
Режим • Амбулаторный, за исключением тяжело болеющих детей младшего возраста, больных с эпидемическим кератоконъюнктивитом и детей младшего возраста с тяжёлой пневмонией • Постельный режим на период повышенной температуры тела.
Лекарственная терапия — лечение симптоматическое • При необходимости — парацетамол по 0,2–0,4 г на приём 2–3 р/сут (10–15 мг/кг/сут). Не рекомендован приём ацетилсалициловой кислоты • Противокашлевые и отхаркивающие средства • ГК (местно) — при конъюнктивите (после консультации офтальмолога).
Течение и прогноз • Заболевание проходит самостоятельно практически без осложнений • Тяжёлое течение и летальный исход возможны среди детей и больных с нарушениями иммунитета.
Профилактика • Живые пероральные вакцины против аденовирусов типов 4 и 7, покрытые защищающей от переваривания в кишечнике капсулой, снижают частоту развития ОРВИ • Для персонала различных учреждений и членов семьи больного обязательно частое мытьё рук.
МКБ-10 • A08.2 Аденовирусный энтерит • A85.1+ Аденовирусный энцефалит (G05.1*) • A87.1+ Аденовирусный менингит (G02.0*) • B30.0+ Кератоконъюнктивит, вызванный аденовирусом (H19.2*) • B30.1+ Конъюнктивит, вызванный аденовирусом (H13.1*) • B34.0 Аденовирусная инфекция неуточнённая • J12.0 Аденовирусная пневмония • J02.8 Острый фарингит, вызванный другими уточнёнными возбудителями • J02.9 Острый фарингит неуточнённый • J03.9 Острый тонзиллит неуточнённый.
Приложение. Мезаденит (острый мезентериальный лимфаденит) — воспаление лимфатических узлов, расположенных в брыжейке тонкой кишки; наблюдают преимущественно у детей и подростков; симптоматика напоминает острый аппендицит. Этиология: вирусная инфекция, а также бактерии рода Yersinia. Клиническая картина — боль в животе (может быть сильной), тошнота, рвота и лихорадка; у некоторых больных отмечают дополнительные признаки вирусной инфекции (например, фарингит и миалгию). Диагноз обычно устанавливают при лапаротомии по поводу предполагаемого аппендицита. Лечение: при выделении Yersinia назначают антибиотики. МКБ-10. I88.0 Неспецифический брыжеечный мезаденит.
Роспотребнадзор (стенд)
Роспотребнадзор (стенд)
Аденовирусный энтерит
Аденовирусный энтерит
Согласно имеющимся наблюдениям, гастроэнтериты могут вызывать кишечные аденовирусы, относящиеся к серотипам 40 и 41, которые входят в группу F. Из-за недостаточности проведенных исследований на сегодняшний день трудно определить удельный вес аденовирусных гастроэнтеритов в общей структуре вирусных гастроэнтеритов. Если еще в конце 80-х годов им отводили второе место после ротавирусной инфекции в структуре гастроэнтеритов у детей, то в 90-х годах была установлена доминирующая роль калицивирусов. В ходе исследований, проводившихся в Европе, Азии, Северной и Южной Америке, было показано, что кишечные аденовирусы могут вызывать от 2 до 22% случаев гастроэнтеритов у детей в возрасте до 2 лет.
Что провоцирует Аденовирусный энтерит:
Патогенез (что происходит?) во время Аденовирусного энтерита:
Несмотря на способность кишечных аденовирусов к эпидемическому распространению, сезонность развития заболевания, тем не менее, не доказана. Как правило, кишечные аденовирусы становятся причиной заболевания детей до 2-летнего возраста, причем наиболее высок риск заболеть у детей до года. Вирусы могут иметь нозокомиальное распространение, вызывая вспышки заболевания в стационарах. Среди взрослого контингента развитие гастроэнтерита не описано, хотя вполне возможно, что при контакте с больными детьми взрослые инфицируются и переносят субклинические формы инфекции.
Симптомы Аденовирусного энтерита:
Инкубационный период составляет от 8 до 10 дней.
В отличие от других вирусных гастроэнтеритов кишечные аденовирусы вызывают более длительное заболевание (от 5 до 12 дней, а иногда и до 14 дней).
Принципиальное отличие кишечных аденовирусов от респираторных в том, что у больных не развиваются такие типичные клинические признаки, как назофарингит и кератоконъюнктивит, хотя виремия у этих больных также регистрируется.
Заболевание характеризуется умеренно выраженной интоксикацией, невысокой температурой, сохраняющейся в течение нескольких дней. В тех случаях, когда заболевание продолжается до 2 недель, у больных чаще регистрируется лихорадка неправильного типа, которая иногда носит волнообразный характер.
Диспепсические проявления в виде рвоты и диареи выражены умеренно и сохраняются 1-3 дня и более. Больные значительно чаще, чем при других вирусных гастроэнтеритов, отмечают боль в животе, которая бывает обусловлена увеличением мезентериальных лимфоузлов. Описаны случаи, когда лихорадка и боли в животе были чуть ли не единственными проявлениями аденовирусного гастроэнтерита.
В ряде случаев у больных одновременно с признаками гастроэнтерита могут выявляться изменения со стороны респираторного тракта, однако механизмы и характер формирующейся патологии изучены недостаточно.
Прогноз
Заболевание проходит самостоятельно практически без осложнений.
Диагностика Аденовирусного энтерита:
Лабораторная диагностика основана на обнаружении специфического антигена вируса в кале с помощью ИФА. Реже выделяют вирус в культуре клеток. Для определения серотипа используют реакцию нейтрализации цитопатического эффекта с соответствующей антисывороткой. Для ретроспективной диагностики в РТГА исследуют парные сыворотки, взятые на 1-5-й и 15-20-й день болезни. Также используется РСК.
Лечение Аденовирусного энтерита:
Лечение больных с аденовирусным гастроэнтеритом строится на принципах патогенетической терапии. Выбор наиболее оптимального способа лечения больных зависит от своевременной диагностики, а точнее, лабораторной верификации вирусного генеза заболевания.
Из немедикаментозных методов лечения важное место отводится диетотерапии, что определяется патофизиологическими механизмами развития диарейного синдрома. На высоте клинических проявлений заболевания следует исключить из пищи молоко и молочные продукты, ограничить прием углеводов, сахара, овощей и фруктов. По мере купирования клинических признаков заболевания диета постепенно расширяется. Учитывая, что в острый период заболевания у больных формируется ферментопатия, целесообразно назначать им комбинированные ферментные препараты, такие, как фестал, панзинорм, мезим форте и другие. Обоснованной является также терапия адсорбирующими и вяжущими препаратами, которые, в частности, способствуют оформлению кала и урежению кратности дефекации, хотя это мало влияет на развитие дегидратации. К числу таких средств относятся полифепан, смекта, препараты висмута и другие.
В литературе имеются указания на положительное влияние на течение аденовирусного гастроэнтерита различных пробиотиков. Патофизиологическим обоснованием их применения у больных с аденовирусным гастроэнтеритом служит тот факт, что штаммы, входящие в состав пробиотиков, самым непосредственным образом участвуют в процессах пищеварения, обмена веществ и детоксикации. Кроме того, у больных могут выявляться дисбиотические изменения в кишечнике.
Поскольку основным проявлением аденовирусного гастроэнтерита, определяющим тяжесть течения заболевания, является дегидратация, купирование обезвоживания составляет основу патогенетической терапии. Принципы регидратационной терапии на сегодняшний день разработаны достаточно хорошо и носят универсальный характер. В зависимости от степени дегидратации регидратацию проводят пероральным или внутривенным способом.
Пероральная регидратационная терапия проводится в том случае, если у больных отсутствуют выраженные системные проявления обезвоживания. Она проводится глюкозоэлектролитными растворами (цитроглюкосоланом, регидроном и другими), которые принимаются дробно, по 1–1,5 л в час.
Внутривенная терапия назначается больным в случае выраженных системных проявлений или при наличии неукротимой рвоты, затрудняющей оральную регидратацию. Эта терапия проводится сбалансированными полиионными кристаллоидными растворами, такими, как трисоль, квартасоль, хлосоль и другие. Объем вводимых растворов и скорость их введения определяются степенью обезвоживания. В тех случаях, когда у больных проявления интоксикации доминируют над симптомами обезвоживания, допускается введение коллоидных растворов (гемодеза, реополиглюкина и других).
Какие клетки поражает аденовирус при попадании в кровь
В журнале Nature опубликован очень подробный обзор, характеризующих особенности строения и жизненный цикл SARS-CoV2, механизмы инфицирования и избегания своевременного иммунного ответа, обозначены потенциальные мишени для создания противовирусных препаратов. Также представлены результаты компьютерного моделирования строения вируса и механизмов проникновения в клетку.
Особенностью данного вируса является наличие очень большого количества гликанов на поверхности спайк-протеина, маскирующих его от иммунной системы человека. Поэтому на первом этапе заболевания вирус подобен «волку в овечьей шкуре» и остается невидим для иммунной системы. В дальнейшем, когда вирус уже размножился, иммунный ответ может развиться даже избыточно, что, по-видимому, лежит в основе тяжелого течения заболевания.
В S2- субъединице спайк-протеина есть три участка, делающих «ножку» спайк-протеина гибкой, что позволяет ей «искать» рецепторы на клетках хозяина более эффективно. Такая структура довольно редка для вирусов, обычно аналогичные «шипики» на поверхности вириона ригидны (такова, например, ситуация у вируса гриппа).
Важной частью спайк-протеина является RBD-домен, функцией которого является связь с рецептором ACE2 на поверхности клетки-хозяина. У SARS-CoV2 эта связь в 2-4 раза сильнее, чем у вируса SARS. Во время взаимодействия с рецептором этот домен «выдвигается» из-за двух маскирующих его молекул гликанов. Исследования in vitro показали, что мутации в этих двух гликанах могут полностью нарушать процессы проникновения вируса в клетку. Для эффективного взаимодействия RDB и ACE2 предпочтительна более «высокая» позиция этого домена на остальными структурами. У альфа варианта вируса найдено 10 дополнительных мутаций, приводящих RBD – домен в более «высокое» положение, а у дельта вируса – еще 3 мутации.
Попав в клетку, вирус подавляет экспрессию генов клетки-хозяина, в том числе – образование интерферонов, сигнализирующих о вирусной инфекции. Для ковидной инфекции типична очень низкая концентрация интерферонов в крови.
В дальнейшем может происходить формирование синцитиев из клеток легочной ткани. Считается, что синцитии позволяют дольше и эффективнее вырабатывать вирусные белки. Такой тип агрессии типичен для персистирующих вирусов – например, ВИЧ. SARS-CoV2 индуцирует даже формирование синцитиев клеток респираторного эпителия с лимфоцитами, что мешает нормальному иммунному ответу. Такой тип «маскировки» от иммунитета типичен для опухолей, а не вирусов.
В дальнейшем перестраивается эндоплазматический ретикулум с формированием шарообразных двухмембранных структур, в которых происходит активный синтез белков вируса. Выход вирионов наружу осуществляется в лизосомах, формирующихся в комлексе Гольджи, путем экзоцитоза. Считается, что молекулярные механизмы, ответственные за описанные процессы, могут быть мишенями для противовирусной терапии.
В месте соединения S1 и S2 субъединиц спайк-протеина есть зона, которая способна связывать и быть расщепленной фурином – протеазой клетки-хозяина, содержащейся в лизосомах. Такое предварительное расщепление значительно упрощает в дальнейшем взаимодействие с трансмембранной протеазой TMPRSS2 и значительно увеличивает проникновение вирусной частицы в следующую клетку. Для вируса SARS показано, что порядка 10% вирусных частиц на выходе из клетки – хозяина связано с фурином. У вируса SARS-CoV2 в соответствующем локусе, отвечающем за связь с фурином, идентифицированы мутации. Как следствие, до 50% вирионов альфа-разновидности SARS-CoV2, выходящих из клетки-хозяина, связаны с фурином, а в случае дельта-вируса – до 90%, что, по-видимому, и объясняет более агрессивное распространение этого варианта вируса. Есть данные, что у пациентов с дельта-формой в тканях легких и носоглотки содержание вирионов достоверно выше, чем у носителей альфа-формы.
По материалам: Megan Scudellari. How the coronavirus infects cells — and why Delta is so dangerous. Nature 595, 640-644 (2021). doi:
Аденовирус IgG (п/кол) в Москве
Определение количества IgG к аденовирусу для диагностики заболеваний, которые могут быть связаны с данным возбудителем.
Приём и исследование биоматериала
Когда нужно сдавать анализ Аденовирус IgG (п/кол)?
Подробное описание исследования
Аденовирус представляет собой ДНК-содержащий вирус, распространенный как среди животных, так и среди людей. Существует более 100 различных типов аденовирусов, 49 из которых способны инфицировать человека.
Существует много способов распространения аденовируса. Он передается воздушно-капельным путем при кашле или чихании, контактным при соприкосновении с зараженными предметами, водным при купании в бассейне, а также фекально-оральным путем из-за несоблюдения правил личной гигиены. Вспышки аденовирусной инфекции распространены в детских садах, закрытых или многолюдных местах, таких как казармы, общественные бассейны, медицинские учреждения.
Подобное разнообразие способов передачи вируса связано с тем, что он может проникать во многие ткани и клетки организма. Аденовирус поражает слизистую оболочку дыхательных путей, желудочно-кишечного тракта, глаз, может проникать в почки и другие органы, что имеет значение в случаях иммуносупрессии – подавления иммунитета.
Данный возбудитель способен существовать в лимфатической системе и других тканях в течение многих лет; у пациентов с ослабленным иммунитетом может произойти его реактивация.
Аденовирусная инфекция чаще всего встречается ранней весной или зимой, но может возникать и в течение года без четкой сезонности. Восприимчивость у детей выше в возрасте от 6 месяцев до 2 лет. Инкубационный период после заражения аденовирусом длится от 2 до 14 дней.
Большинство аденовирусных инфекций протекает бессимптомно. Проявлением заражения данным возбудителем может быть острая респираторная инфекция, или простуда. У человека появляется общее ухудшение самочувствия, умеренная лихорадка, боль в горле, мышцах, ломота в суставах, насморк. Распространение инфекции в гортань и трахею способствует возникновению сухого кашля, осиплости. Иногда поражение горла осложняется воспалением евстахиевой трубы и уха – средним отитом.
Кроме того, при аденовирусной инфекции может наблюдаться:
Кератоконъюнктивит проявляется воспалением слизистой оболочки глаза – конъюнктивы, реже – роговицы. Инфицированный человек отмечает ощущение «песка» в глазах, слезотечение, отек век, склеивание ресниц из-за обилия отделяемого из глаза. Нарушение зрения связано с поражением роговицы и требует обращения к врачу.
Размножение вируса в слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта приводит к ее воспалению, а также увеличению лимфоузлов брыжейки – мезадениту, что проявляется болями в животе, иногда имитирующими острый аппендицит. Наблюдается диарея, снижение аппетита, тошнота.
Проникновение в урогенитальный тракт наиболее часто приводит к воспалению мочевого пузыря. Геморрагический цистит протекает с болезненным учащенным мочеиспусканием, появлением крови в моче.
Обнаружение указанных симптомов служат показанием для выявления аденовирусной инфекции у человека. Иммунная система в борьбе с вирусом выделяет антитела, при этом в первые недели болезни продуцируются иммуноглобулины класса М, что является признаком острой инфекции, далее они замещаются иммуноглобулинами класса G, что означает выздоровление и формирование иммунитета к возбудителю. Оценка IgG в крови позволяет проводить дифференциальную диагностику инфекций дыхательной системы и других органов.
Крохотные курьеры: как аденоассоциированные вирусы спасают жизни
Крохотные курьеры: как аденоассоциированные вирусы спасают жизни
Авторы
Редакторы
Конкурс «Био/Мол/Текст»-2020/2021
Эта работа опубликована в номинации «Вирусы и микроорганизмы» конкурса «Био/Мол/Текст»-2020/2021.
Генеральный партнер конкурса — ежегодная биотехнологическая конференция BiotechClub, организованная международной инновационной биотехнологической компанией BIOCAD.
Спонсор конкурса — компания SkyGen: передовой дистрибьютор продукции для life science на российском рынке.
Спонсор конкурса — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.
Введение
Эта история началась в середине 1960-х, когда в препаратах аденовируса обезьян случайно было обнаружено загрязнение из маленьких неизвестных частиц [1]. Эти частицы были впоследствии названы аденоассоциированным вирусом (сокращенно ААВ, англ. adeno-associated virus, AAV). Тогда мало кто мог предположить, что именно эти крошечные вирусы дадут надежду многим неизлечимым больным. И лишь несколько исследовательских групп, движимых чисто научным любопытством, отправились изучать базовую биологию ААВ.
Прошло несколько десятков лет, и стало понятно, что ААВ обладает множеством уникальных свойств. Эти особенности позволяют использовать его в поистине революционном направлении — генной терапии. По разным оценкам, около 5% новорожденных детей страдает от различных генетических заболеваний [2]. Долгие годы такие болезни считались неизлечимыми, и для многих подобный диагноз приравнивался к приговору. К счастью, времена изменились. Мы находимся на пороге эры лекарств принципиально нового типа [3], и немаловажную роль в этом сыграл аденоассоциированный вирус [4].
Биология вируса
Какими же уникальными особенностями обладает ААВ? Чтобы ответить на этот вопрос, нужно подробнее поговорить про его жизненный цикл и строение.
Аденоассоциированный вирус принадлежит к роду Dependoparvovirus семейства Parvoviridae. Название рода отражает его необычный жизненный цикл, когда для размножения необходимо наличие вспомогательного вируса (от лат. Dependo — «зависеть»). В качестве такого вируса-помощника, как правило, выступает аденовирус (что явно следует из названия) или представители семейства герпесвирусов [5].
ААВ настолько безобиден, что помимо неспособности самостоятельно размножаться, он не вызывает никаких заболеваний человека и животных. Более того, согласно некоторым исследованиям, большинство людей (>70%) в течение жизни были заражены одним или несколькими серотипами ААВ [6]. (Серотип — вариант вируса, который отличается от других антигенами на своей белковой оболочке).
Вирус довольно мал — его икосаэдрическая белковая оболочка (капсид) в диаметре составляет всего около 25 нм (риc. 1а). Капсид необычайно стабилен: устойчив к кратковременному воздействию тепла, кислой среде и протеазам [7]. Геном, представленный одноцепочечной ДНК, по размерам также весьма скромен — всего 4,7 тысяч нуклеотидов [7].
Этот небольшой геном содержит минимальное количество генов. Ген rep (от слова replication) кодирует белки, необходимые для размножения вируса и его дальнейшей сборки внутри клетки (рис. 1б). Ген cap (от слова capsid) кодирует белки капсида (рис. 1б).
Геном ААВ обрамлен двумя Т-образными шпильками — инвертированными концевыми повторами (inverted terminal repeats, ITR) (рис. 1б).
Рисунок 1. Аденоассоциированный вирус. а — Модель капсида ААВ. б — Геном аденоассоциированного вируса. ITR (inverted terminal repeats) — инвертированные концевые повторы, образующие Т-образные шпильки; rep — ген, кодирующий белки, отвечающие за репликацию; cap — ген, кодирующий белки капсида.
Судьба вируса в клетке
Ценное свойство ААВ — его способность проникать как в делящиеся, так и неделящиеся клетки [8]. На первом этапе аденоассоциированный вирус связывается с рецептором на поверхности клетки (рис. 2) [9]. Разные серотипы ААВ предпочтительно связываются со своими рецепторами, характерными для определенных типов клеток [10].
Рисунок 2. Проникновение ААВ внутрь клетки. Пояснения в тексте.
[9], рисунок с изменениями
И это важное свойство — определенный серотип преимущественно проникает лишь в конкретную ткань или орган, то есть обладает своим уникальным тропизмом.
Связывание вируса с рецептором запускает процесс проникновения внутрь клетки. Эндосома (мембранный пузырек, содержащий вирусную частицу) передвигается в цитоплазме по цитоскелету. Постепенно среда в эндосоме закисляется, что приводит к изменениям капсида, необходимым для дальнейшего успешного заражения клетки. После выхода из эндосомы у вируса два пути. Либо он попадает в клеточную машину по уничтожению белков (протеасому) и разрушается, либо переносится в ядро, где вирусный геном высвобождается из капсида (рис. 2) [10].
С одноцепочечного вирусного генома еще не могут нарабатываться белки, для этого необходимо достроить вторую цепь ДНК. Она синтезируется с помощью ДНК-полимеразы клетки-хозяина, используя шпильку ITR в качестве затравки для построения второй цепи.
Вирусные ITR помогают не только строить вторую цепь ДНК, но способствуют межмолекулярной и внутримолекулярной рекомбинации геномов вируса. В результате в ядре клетки образуются кольцевые молекулы ДНК — эписомы (рис. 2). В такой форме геномы ААВ могут в течение многих лет присутствовать в ядре [10].
Кроме того, геном ААВ может с низкой частотой встраиваться в определенный локус на 19 хромосоме человека [11]. Этот феномен обусловлен сходством последовательностей ДНК данного локуса и ITR вируса. У ААВ, лишенного гена rep, способность к встраиванию своего генома сильно снижена. Такие вирусные геномы присутствуют в клетках в виде эписом.
Модификация ААВ для применения в генной терапии
Если в гене человека произошла мутация, которая привела к развитию заболевания, то болезнь можно победить или облегчить, если доставить в клетки организма рабочую копию поломанного гена. Вот тут и выходит на сцену аденоассоциированный вирус.
Что же нужно было в нем изменить, чтобы он стал курьером для доставки таких терапевтических генов? Как это часто бывает в биологии, ученые просто воспользовались успешными решениями, уже созданными природой. Раз капсид ААВ сам по себе является ключом к входу в клетку и ядро, то можно смело этим воспользоваться. Остается только заменить гены самого вируса на гены, интересующие исследователя, и вирусный курьер готов!
Модификация генома ААВ
Оказалось, что от всего генома ААВ необходимо было оставить только концевые шпильки ITR, необходимые для сборки самого вируса и сохранения его генома в ядре (рис. 3) [12]. Таким образом, можно без последствий удалить до 96% генома ААВ, используя полученное пространство для кодирования нужных генов.
Так как ААВ вмещает в себя всего около 5000 пар нуклеотидов, то нужно очень тщательно продумать остальной состав кассеты. В первую очередь туда необходимо поместить рабочую копию гена (трансген), в зависимости от того генетического заболевания, на которое направлено лечение. Также обязательно наличие регуляторных последовательностей, таких как промотор и сигнал полиаденилирования (рис. 3). Разберем элементы кассеты подробнее.
Рисунок 3. Компоненты типичной кассеты ААВ вектора. Оранжевые блоки (промотор, трансген и сигнал полиаденилирования — рА) являются обязательными компонентами. Для повышения эффективности экспрессии могут быть включены необязательные регуляторные элементы, такие как интрон (I) и другие компоненты 3′-нетранслируемой области (НТО). Кассета обрамлена инвертированными терминальными повторами (ITR).
рисунок авторов статьи
Из-за ограниченной емкости вируса могут возникнуть трудности с доставкой больших терапевтических генов. Очевидное решение проблемы — разработка сокращенной версии гена, который кодирует усеченный, но функциональный белок. Создание таких укороченных генов требует глубокого понимания биологии терапевтического белка, взаимосвязи его структуры и функции. Такой подход уже успешно применяется в нескольких клинических испытаниях по лечению миодистрофии Дюшенна [13] (ссылки на клинические испытания: NCT03368742, NCT04281485, NCT03769116), в доклинических исследованиях по лечению дисферлинопатии, амавроза Лебера и многих других заболеваний.
Другим потенциально перспективным подходом для доставки слишком больших трансгенов может быть разделение гена между двумя ААВ-векторами [14]. Два этих векторных генома, попадая в одно и то же ядро клетки, могут подвергаться межмолекулярной рекомбинации с последующим восстановлением полноразмерного гена. Такой двухвекторный подход пока применяется лишь в редких клинических испытаниях (пример — NCT02710500). Низкая эффективность восстановления полноразмерного гена ограничивает более широкое применение этого приема.
Правильно выбранный промотор — во многом залог успешной генной терапии. Идеальный промотор должен запускать стабильную высокую экспрессию трансгена в пораженных органах в течение длительного периода, при этом быть неактивным в других тканях. Малая емкость ААВ также требует уменьшения размера промотора [15].
К кассету можно добавить необязательные элементы, способные улучшить экспрессию трансгена (рис. 3). Так, например, присутствие интрона повышает стабильность РНК в ядре [16], а также способствует эффективному транспорту мРНК из ядра в цитоплазму [17].
К обеспечению тканеспецифичности можно подойти с другой стороны — не только стимулируя экспрессию в целевых тканях, но и подавляя ее в нежелательных органах с помощью механизмов РНК-интерференции [18]. Для этого в 3′-НТО-кассеты добавляют сайты связывания микроРНК, присутствующих строго в нецелевых органах (рис. 3) [19]. Если трансген оказывается в нежелательном органе, то микроРНК связывается с комплементарными ей сайтами в транскрипте и запускает его деградацию.
Модификация капсида ААВ
Хотя капсид ААВ — сам по себе уже удачное изобретение природы, человечество не остановилось в своем научном поиске. Новые серотипы ААВ могут обладать рядом преимуществ:
Благодаря развитию новых методов анализа выделяют несколько основных направлений для создания или выявления новых серотипов.
К сожалению, всегда существует вероятность, что хорошо работающий in vitro модифицированный капсид в экспериментах на лабораторных животных продемонстрирует низкую эффективность или даже токсичность. Всестороннее изучение свойств разрабатываемых препаратов и строгий контроль качества призваны минимизировать риск неблагоприятного исхода исследований [23].
Применение ААВ в клинике
Целевые органы, на которые направлена терапия
К 14 декабря 2020 года 227 препаратов на основе ААВ проходят клинические испытания (по данным сайта ClinicalTrials.gov). Сегодня уже существует несколько препаратов на основе ААВ, которые получили одобрение от регулирующих органов для коммерческого использования у пациентов (подробнее про эти препараты можно почитать в [4]):
Большинство серотипов ААВ «предпочитают» проникать в такие органы, как печень, поперечно-полосатые мышцы и ЦНС, что и определило направление большинства программ генной терапии (рис. 4).
Рисунок 4. Данные с сайта ClinicalTrials.gov: на 13 ноября 2018 г. было зарегистрировано 145 клинических испытаний с использованием ААВ. а — Классифицикация клинических испытаний на основе примененного серотипа ААВ (AAV). б — Целевой орган, на который направлена терапия в указанных клинических испытаниях. Можно заметить, что спустя два года количество клинических испытаний с применением ААВ почти удвоилось (227 на сегодняшний день против 145 испытаний два года назад).
Почти все природные серотипы ААВ эффективно заражают печень после внутривенного введения. Благодаря данному свойству вируса в клинических испытаниях находятся препараты для лечения гемофилии A и B (NCT03392974, NCT03587116), семейной гиперхолестеринемии (NCT02651675), дефицита орнитинтранскарбамилазы (NCT02991144), мукополисахаридоза-IIIA (NCT03612869) и синдрома Криглера—Найяра (NCT03223194) [25].
Серотипы ААВ8 и ААВ9 могут эффективно заражать разные типы мышц по всему телу. Такое свойство делает их идеальными векторами для генной терапии множества мышечных заболеваний [26]. Так, активно исследуются в клинике препараты для лечения миодистрофии Дюшенна (NCT03375164), дисферлинопатии (NCT02710500), миотубулярной миопатии (NCT03199469), болезни Помпе (NCT03533673). Примечательно, что зараженная мышца может также служить биофабрикой для производства секретирующихся терапевтических белков для лечения немышечных заболеваний. Хотя большинство сердечных заболеваний полигенны и подвержены влиянию окружающей среды, ведется разработка препаратов генной терапии для лечения сердечной недостаточности [26].
Большой процент разрабатываемых препаратов на основе ААВ направлен на лечение неврологических и глазных болезней (рис. 4) [27], [28]. Глаз — весьма обособленный орган, обладающий уникальной иммунологической толерантностью, и легко доступный для прямого введения препарата. Нетрудно понять, почему один из первых одобренных препаратов, «Люкстурна», был направлен именно на лечение наследственной слепоты. Мозг, напротив, намного более крупный и сложно организованный орган. Прямая доставка препарата в мозг или спинномозговую жидкость позволяет локализовать вирус и снизить дозу препарата, но это инвазивная процедура, сопряженная со многими рисками. К счастью, такие серотипы, как ААВ9 или ААВrh.10, могут пересекать гематоэнцефалический барьер, что позволяет использовать рутинное внутривенное введение. В настоящий момент в клинических испытаниях уже находятся препараты для лечения болезни Паркинсона (NCT02418598), метахроматической лейкодистрофии (NCT01801709), болезни Баттена (NCT01414985), мукополисахаридоза 3 типа (NCT03300453).
Основные стратегии генной терапии на основе рААВ
Можно выделить 4 глобальных направления генной терапии с применением ААВ (рис. 5).
Рисунок 5. Основные стратегии генной терапии на основе ААВ. Пояснения в тексте.
[29], рисунок с изменениями
Производство ААВ
Когда речь идет о клинических испытаниях, требуется очень большое количество вирусного препарата высокого качества. Его производство — весьма нетривиальная задача.
Вирусы не могут самостоятельно себя воспроизводить, им необходима помощь клеточной машинерии. Для наработки ААВ стали использовать культуры клеток. Вариантов может быть много: использование культуры дрожжей (Saccharomyces cerevisiae) [33], клеток насекомых (культура клеток Sf9 бабочки Spodoptera frugiperda) [34], человека — HEK293, HeLa. Некоторые из этих подходов, — скорее, экзотика, но использование культур клеток млекопитающих (HEK293) или насекомых (Sf9) уже прочно закрепилось на производстве.
Итак, для начала необходимо определиться с методикой производства, ведь от этого зависит, в чем будет расти сама культура. Вариантов масса: для клеток, растущих, прикрепившись к субстрату, это могут быть большие чашки Петри, специальные сосуды с множеством перегородок для увеличения площади поверхности (рис. 6а). Для культур, хорошо чувствующих себя в виде суспензии и при постоянном перемешивании, — колбы, герметичные пакеты и многое другое. При увеличении масштабов производства можно переходить на специальные биореакторы (рис. 6б). С их помощью можно следить за целой панелью важных для процесса параметров. Они делают производство более технологичным и позволяют увеличить объемы продукции до нескольких сотен литров вирус-содержащей суспензии за один цикл работы.
Рисунок 6. Производство ААВ: на культуральных чашках (а) и в биореакторе iCellis Nano (Pall corporation) (б)
фотографии авторов статьи
Что нужно сделать с культурой клеток, чтобы она стала биофабрикой по производству вирусных частиц? В такие клетки-производители вносят плазмидную ДНК, кодирующую необходимую для сборки вирусов информацию. Наиболее популярный протокол предполагает одновременное заражение клеток тремя плазмидами (рис. 7):
Кстати, вместо третьей плазмиды может быть добавлен сам вирус-помощник (аденовирус или герпесвирус), как это было в более ранних протоколах по производству частиц ААВ [35].
Рисунок 7. Производство ААВ, использующее в качестве клеток-производителей культуру клеток человека HEK293. Смесь трех плазмид доставляют внутрь клетки (плазмиду с терапевтическим геном, плазмиду, кодирующая гены rep/cap, и плазмиду с генами вируса помощника). Начинается наработка необходимых белков для сборки вирусных частиц. ДНК, содержащая терапевтический ген, упаковывается в готовый капсид ААВ.
Клетки начинают производить вирусные частицы, после чего их надо собрать и очистить.
Это критически важный этап, которому стоит уделить особое внимание [22], [23]. Любые примеси, которые будут содержаться в препарате, могут вызвать нежелательный иммунный ответ.
Вначале собирают сырой материал: это может быть клеточная среда, если вирусы выделяются клетками преимущественно в жидкость вокруг, а могут быть и сами клетки, если большинство вирусных частиц накапливается внутри. Как правило, это зависит от конкретного серотипа ААВ. Чтобы разрушить клеточные мембраны и высвободить вирус, клетки подвергают многочисленным циклам замораживания-оттаивания, ультразвуковой обработке или воздействию детергентов.
Теперь основная задача — очистить вирусные частицы от многочисленных примесей, находящихся в суспензии (рис. 8). В сыром материале находятся внутриклеточные свободные ДНК и РНК, белки и ферменты, крупные обломки клеточных мембран и многое другое. Способов очистки существует множество, и постоянно появляются как улучшенные версии уже применяемых методик, так и принципиально новые подходы. Все они различаются по уровням специфичности, эффективности и, разумеется, стоимости. Условно способы очистки можно разделить на серотип-специфичные и универсальные. К первой категории относится, например, аффинная хроматография [37], основанная на специфическом узнавании капсидов антителами. Ко второй — ультрацентрифугирование в градиентах плотности растворов йодиксанола или хлорида цезия, преципитация полиэтиленгликолем или сульфатом аммония, ионообменная хроматография и многие другие методы, основанные на общих физических свойствах вирусных частиц [38].
Рисунок 8. Окрашивание серебром очищенного (лунки 1–3) и загрязненного другими белками (лунки 4–8) препарата ААВ после гель-электрофореза [38].
Одна из неочевидных нежелательных примесей — так называемые пустые капсиды — вирусные частицы, не несущие в себе терапевтический ген, или содержащие внутри себя постороннюю ДНК. Дело в том, что изначально в клетке формируется пул пустых капсидов. Лишь потом ДНК связывается с пустым капсидом при помощи специальных сигналов на ITR и компактно упаковывается, формируя полноценную вирусную частицу. Но иногда пустой капсид может так и остаться пустым при нехватке вирусной ДНК или ее неэффективной упаковке. В пустой капсид может также упаковаться обрывок свободной ДНК, находящейся в клетке и содержащей последовательность, схожую с сигналом упаковки. Такие частицы (совсем пустые или несущие неправильную последовательность) не функциональны и подлежат удалению из очищаемого препарата. С определенной эффективностью их можно отделить от функциональных капсидов, используя градиенты плотности или методы хроматографии.
Основные проблемы
Наработка большого количества плазмид высокой степени очистки, поддержание культур клеток, дорогостоящие реактивы, сложный процесс очистки вирусных частиц и разработка аналитических методик для характеризации препаратов ведут к таким космическим ценам при масштабировании производства. На стоимость также влияет серьезный контроль качества вирусного препарата. Чтобы препарат вышел на рынок, проводятся исследования его токсичности, безопасности, биораспределения, эффективности. Оценивается содержание белковых примесей, бактериальных эндотоксинов, количество пустых капсидов, стерильность препарата, концентрация вирусных частиц в растворе и множество других характеристик [23]. В настоящий момент гиганты производств ААВ по всему миру работают над удешевлением препаратов, разрабатывая более эффективные протоколы сборки и очистки ААВ.
Иммунный ответ также представляет собой серьезную проблему. Потенциально иммунные реакции могут возникать на вирусный капсид, его геном, а также на белковый продукт трансгена. Препаратам на основе ААВ могут помешать нейтрализующие антитела к его капсиду [39]. Связываясь с вирусами в кровотоке, антитела препятствуют проникновению вирусных частиц в клетки, что ведет к низкой эффективности препарата. В настоящий момент обязательно проводится скрининг пациентов на наличие антител к применяемому серотипу ААВ [40]. В случае их обнаружения такой пациент исключается из клинических испытаний. Ведется разработка новых капсидов, которые не будут узнаваться нейтрализующими антителами [41]. После доставки терапевтических доз ААВ быстро развивается гуморальный иммунный ответ, который впоследствии помешает повторному введению препарата [42]. Именно поэтому большинство генотерапевтических препаратов на основе ААВ рассчитано на однократное введение. Для подавления Т-клеточного иммунного ответа у пациентов применяется фармакологическая супрессия стероидами [40].
Заключение
Генная терапия на основе ААВ — бурно развивающееся направление, и мы в данном обзоре затронули лишь небольшой кусочек этой удивительной области. Текущий экспоненциальный рост клинических испытаний с использованием ААВ предполагает, что мы находимся в самом начале эры новых генотерапевтических препаратов. Еще очень много задач предстоит решить, и для этого требуются мультидисциплинарные усилия. Дальнейшее развитие молекулярной биологии, биоинформатики, эпидемиологии, структурной биологии, иммунологии, геномики и других дисциплин, безусловно, будет способствовать совершенствованию технологии. Уже пройден длинный путь в попытке человечества победить генетические заболевания. Мы надеемся, что именно генная терапия приведет к окончательной победе!