для использования in vitro что это значит
Диагностика или тестирование in vitro. Что это такое?
In vitro — латинское выражение, означающее, буквально, «в стекле». In vitro медицинские тесты — это тесты, проводимые в контролируемом окружении вне живого организма.
Определения:
Термин in vitro означает, что медицинские процедуры, тесты и эксперименты проводятся вне живого организма. Исследование in vitro проводится в контролируемой среде, к примеру такой, как пробирка или чашка Петри.
Термин in vivo, означает, что исследование проводится в естественных условиях. Это относится к тестам, экспериментам и процедурам, которые ученые выполняют на живом организме, таком как человек, лабораторное животное или растение.
Тестирование in vitro — это по сути простая методология исследования. Ученые могут проводить детальные анализы и изучать биологические эффекты у гораздо большего числа объектов in vitro, чем в экспериментах на животных или людях. Однако, хотя чашки Петри и пробирки обеспечивают контролируемую среду для испытаний in vitro, они не могут воспроизвести все те условия, которые происходят внутри живого организма. Таким образов, интерпретировать данные in vitro необходимо с осторожностью, так как полученные результаты не могут со 100% гарантией точно предсказать результаты исследований в реалии живого существа.
Один из примеров исследований in vitro — фармацевтические испытания новых лекарственных препаратов, которые проходят тестирование in vitro, прежде, чем начинаются клинические испытания.
В применении к методикам и рекомендациям проведения тестирования на выявление антител и антигенов коронавирусной инфекции, in vitro диагностика включает следующие рекомендации:
ООО «Группа АРТОС»
ИНН 7728694854, ОГРН 1097746127401
г. Москва, ул. Бутлерова 17 Б
In vivo — in vitro — in silico
In vivo — in vitro — in silico
Кремний (Si), химический элемент IV группы периодической системы Менделеева; атомный номер 14, атомная масса 28,086. Кремний — полупроводник, нашедший широкое применение в электронике для изготовления элементов полупроводниковых схем (от простейших транзисторов до сверхбыстрых современных процессоров).
Автор
Редакторы
Статья является введением к теме «Сухая биология» — в ней раскрывается смысл понятия in silico, а так же обсуждается его взаимосвязь с такими устоявшимися терминами как in vivo и in vitro.
Открывая этот новый раздел, хочется сказать несколько вводных слов, так как у большинства читателей наверняка может возникнуть вопрос: «что такое „in silico“?».
За последние несколько десятилетий развитие компьютерной техники достигло небывалых размахов. И как следствие компьютеризация захватила многие отрасли науки и техники. Биология также не является исключением. Если раньше компьютер рассматривался лишь как средство обработки экспериментальных данных, характер которых мог быть чрезвычайно разнообразным, от статистических исследований численности популяций, до обработки данных рентгеноструктурного анализа, то со временем стала развиваться идея полностью компьютерного эксперимента. Теперь компьютер стал рассматриваться как среда проведения эксперимента, т.е. имея на входе определенные исходные параметры, мы можем получить некие результаты моделирования, описывающие поведение исследуемой нами системы. Для обозначения всего, что связано с компьютерными экспериментами, в 90-е годы XX века даже возник полушутливый латинизм — in silico (от in silicon, т.е. «в кремнии» — подробнее см. 1–2), который дополнил ряд уже имеющихся еще с конца позапрошлого столетия классических определения характера экспериментальной среды — in vivo («вживую» — т.е. непосредственно в биологической системе), in vitro («в стекле», то есть в среде искусственно созданной — в пробирке), см. рис. 1. Термины in vivo и in vitro хорошо прижились среди экспериментаторов, однако смысл их использования достаточно относителен. Так, под in vivo молекулярный биолог, изучающий аспекты синтеза белка, может подразумевать колонию искусственно выращенных клеток, а под in vitro — систему бесклеточного синтеза в пробирке. При этом, для физиолога, изучающего механизмы проведения нервного импульса, in vivo — это целый организм, а in vitro — культура нервной ткани. В свою очередь, подход in silico также многоуровневый и включает в себя задачи по моделированию поведения отдельных молекул, биохимических процессов и даже функционированию отдельных физиологических систем.
Рисунок 1. Многоуровневый подход в изучении биологических систем: in vivo — т.е. в живом объекте (а), in vitro — т.е. в искусственно смоделированной среде (б), in silico — т.е. в полностью смоделированной на компьютере биологической системе (в).
Учитывая тематику нашего сайта, в разделе «Сухая биология» мы будем помещать материалы, в основном посвященные современным методам молекулярного моделирования. Молекулярное моделирование — это один из аспектов понятия in silico, который представляет из себя набор вычислительных методов, позволяющих с разной степенью физичности на атомарном уровне изучать молекулярные системы разной сложности. Методы молекулярного моделирования можно разбить на определенные группы, которые объединяют различные подходы, позволяющие решать задачи разного характера. К первой такой группе можно отнести все методики анализа биологических текстов (аминокислотных и нуклеотидных последовательностей), а также работу с соответствующими базами данных — ныне эта область получила специальное определение — биоинформатика. Следующая группа методов объединяет методики изучения эволюции молекулярных систем с использование эмпирических силовых полей. Набор подходов, позволяющих определять пространственную структуру белковых молекул, учитывая имеющиеся структурные шаблоны белков с гомологичными аминокислотными последовательностями, получил название моделирование на основании гомологии. Наконец, специальные подходы, позволяющие изучать взаимодействия типа лиганд-рецептор или фермент-субстрат, относятся к области молекулярного докинга. Обо всем этом вы узнаете подробнее на страницах раздела «Сухая биология».
Пытаемся разобраться в медицинских исследованиях: в чем разница между in vivo и in vitro
В эпоху информационного шума и огромного количества тревожных новостейж всегла лучше обращаться к первоисточнику. Начнем с азов: эти два термина звучат очень похоже, их часто путают. Но смысловое значение существенно различается (это на самом деле важно знать).
Исследования в науке и медицине
Для того, чтобы запустить в массовое производство различные препараты – косметические, лекарственные или БАДы, они должны пройти ряд испытаний, которые подтвердят эффективность и безопасность этих средств. Тогда и проводится серия экспериментов с приставкой in vitro и in vivo. Слова во многом похожи, однако между ними есть очень большая разница. Они обозначают совершенно разные виды испытаний. Разберемся с этими понятиями на примере косметических средств и испытаний лекарств, вакцин.
Исследования in vitro и in vivo, а также некоторые другие, проводятся в отношении эффективности косметических продуктов для жирной или сухой кожи, увлажнения, старения кожи, пигментации, роста волос и т. д. Также они изучают безопасность и эффективность определенных лекарств или добавок.
В чем разница между методами тестирования in vitro и in vivo
Эти эксперименты обычно проводятся в рамках клинических исследований, испытаний новых препаратов, косметических компонентов, биодобавок и различных возбудителей инфекций (вирусы, грибки или бактерии), вакцин или сывороток против них. Научные эксперименты «в пробирках» и на живых объектах необходимы для расширения объема знаний о различных заболеваниях, методах их лечения, работе организма, влиянии на него тех или иных составов. Также эти виды экспериментов применяются для новых научных открытий, проверки теоретических гипотез на практике. Использовать могут как один из методов, так и оба сразу.
Что такое методы тестирования in vitro и ex vivo
Сегодня косметическим брендам доступно множество методов тестирования, которые хотят проверить свои продукты на безопасность, охарактеризовать их эффективность и активные ингредиенты, начать исследования и разработку новых рецептур.
In vitro включает эксперименты с биологическим веществом (клетками или тканями) вне живого организма. Эксперименты in vitro действительно проводятся в стекле – на чашке Петри или внутри пробирки, хотя сегодня им на смену приходят и современные пробирки из пластика или иных материалов.
Одна из особенностей тестирования in vitro заключается в том, что определенная линия клеток (например, кератиноциты, фибробласты или меланоциты – все это клетки кожи) выделяется, отделяется и очищается от их обычного биологического окружения. Это позволяет проводить более подробный клеточный и молекулярный анализ и оценку реакций клеток по сравнению с использованием в рамках всего организма. Кроме того, изолированные клетки, как правило, при правильных условиях можно подращивать и делить, чтобы получить запас и партии для будущего повторного использования.
Эксперименты in vitro можно проводить на широком круге подопытных объектов, от бактерий и вирусов до клеток, полученных из живых организмов. Благодаря современной науке, сейчас доступны все более сложные модели in vitro.
Тестирование косметики и лекарств in vitro и ex vivo
Исследования in vivo
Сходство in vivo и in vitro
Прежде всего, есть одно существенное сходство между in vivo и in vitro: это их цель. Как и во всех медицинских исследованиях, независимо от того, проводятся ли они in vitro или in vivo, цель всегда одна: лучше понять определенное заболевание и способы его лечения, а также расширить знания о различных функциях тела. Тем не менее, в этих исследованиях есть много различий, и зачастую эксперименты в лаборатории проводятся первыми, для того, чтобы убедиться в безопасности методики. Только после этого уже переходят к исследованиям на животных, а потом – на людях-добровольцах.
Активность антибактериальных средств in vitro
Грамотрицательные неферментирующие микроорганизмы широко распространены в окружающей среде. Одной из серьезных проблем является диагностика вызванных ими инфекций, связанная с объективными трудностями их выделения и идентификации. Второй проблемой является то, что для них характерна полирезистентность к антимикробным препаратам, включая те, которые обычно активны против Pseudomonas aeruginosa.
В данном исследовании определялась антибактериальная активность in vitro различных препаратов по отношению к 177 выделенным в клинике штаммам неферментирующих бактерий (кроме Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter spp.). МПК определялась методом разведений в агаре. Использовали среду Мюллера-Хинтона. Оценивали активность ампициллина, пиперациллина, пиперациллин/тазобактама, сульбактама, цефоперазона, цефоперазон/сульбактама, цефтазидима, цефепима, азтреонама, имипенема, меропенема, колистина, гентамицина, амикацина, триметоприм/сульфаметоксазола, хлорамфеникола, эритромицина, рифампицина, норфлоксацина, ципрофлоксацина и миноциклина.
У 7 изолятов: Sphingobacterium multivorum(2), Sphingobacterium spiritivorum(1), Empedobacter brevis(1), Weeksella virosa(1), Bergeyella zoohelcum(1) и Oligella urethralis (1), вместо чувствительности к цефоперазону или сульбактаму определяли чувствительность к амоксициллин/клавуланату и ампициллин/сульбактаму.
Полирезистентность к антибактериальным препаратам была характерна для таких возбудителей, как Stenotrophomonas maltophilia, Burkholderia cepacia, Chryseobacterium spp., Myroides spp., Achromobacter xylosoxidans и Ochrobactrum anthropi.
В то же время, такие микроорганизмы, как Pseudomonas stutzeri, Shewanella putrefaciens-algae, Sphingomonas paucimobilis, Pseudomonas oryzihabitans, Bergeyella zoohelcum, Weeksella virosa и Oligella urethralis часто были чувствительны к большинству из тестируемых антибиотиков.
Учитывая, что различные виды возбудителей, образующих группу грамотрицательных неферментирующих микроорганизмов, демонстрируют различные показатели антибиотикорезистентности, для выбора оптимальной схемы лечения требуется проведение микробиологического исследования с идентификацией возбудителя и выявления показателей его антибиотикорезистентности. Феномен полирезистентности, характерный для ряда возбудителей, требует активной разработки новых антибактериальных средств или поиска новых комбинаций антибиотиков, обладающих синергизмом бактерицидного действия по отношению к данным микроорганизмам.
«In vitro» activity of different antimicrobial agents on Gram-negative nonfermentative bacilli, excluding Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter spp. (Vay C.A., Almuzara M.N., Rodriguez C.H., Pugliese M.L., Lorenzo Barba F., Mattera J.C., Famiglietti A.M. Rev. Argent Microbiol., 2005;37(1):34-45).
Код вставки на сайт
Активность антибактериальных средств in vitro
Грамотрицательные неферментирующие микроорганизмы широко распространены в окружающей среде. Одной из серьезных проблем является диагностика вызванных ими инфекций, связанная с объективными трудностями их выделения и идентификации. Второй проблемой является то, что для них характерна полирезистентность к антимикробным препаратам, включая те, которые обычно активны против Pseudomonas aeruginosa.
В данном исследовании определялась антибактериальная активность in vitro различных препаратов по отношению к 177 выделенным в клинике штаммам неферментирующих бактерий (кроме Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter spp.). МПК определялась методом разведений в агаре. Использовали среду Мюллера-Хинтона. Оценивали активность ампициллина, пиперациллина, пиперациллин/тазобактама, сульбактама, цефоперазона, цефоперазон/сульбактама, цефтазидима, цефепима, азтреонама, имипенема, меропенема, колистина, гентамицина, амикацина, триметоприм/сульфаметоксазола, хлорамфеникола, эритромицина, рифампицина, норфлоксацина, ципрофлоксацина и миноциклина.
У 7 изолятов: Sphingobacterium multivorum(2), Sphingobacterium spiritivorum(1), Empedobacter brevis(1), Weeksella virosa(1), Bergeyella zoohelcum(1) и Oligella urethralis (1), вместо чувствительности к цефоперазону или сульбактаму определяли чувствительность к амоксициллин/клавуланату и ампициллин/сульбактаму.
Полирезистентность к антибактериальным препаратам была характерна для таких возбудителей, как Stenotrophomonas maltophilia, Burkholderia cepacia, Chryseobacterium spp., Myroides spp., Achromobacter xylosoxidans и Ochrobactrum anthropi.
В то же время, такие микроорганизмы, как Pseudomonas stutzeri, Shewanella putrefaciens-algae, Sphingomonas paucimobilis, Pseudomonas oryzihabitans, Bergeyella zoohelcum, Weeksella virosa и Oligella urethralis часто были чувствительны к большинству из тестируемых антибиотиков.
Учитывая, что различные виды возбудителей, образующих группу грамотрицательных неферментирующих микроорганизмов, демонстрируют различные показатели антибиотикорезистентности, для выбора оптимальной схемы лечения требуется проведение микробиологического исследования с идентификацией возбудителя и выявления показателей его антибиотикорезистентности. Феномен полирезистентности, характерный для ряда возбудителей, требует активной разработки новых антибактериальных средств или поиска новых комбинаций антибиотиков, обладающих синергизмом бактерицидного действия по отношению к данным микроорганизмам.
КОМПЛЕКСНЫЙ ПОДХОД К ИЗУЧЕНИЮ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ IN VITRO, EX VIVO, IN VIVO
1 Кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник, 2 младший научный сотрудник, 3 младший научный сотрудник, ЗАО «Санкт-Петербургский институт фармации»
КОМПЛЕКСНЫЙ ПОДХОД К ИЗУЧЕНИЮ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ IN VITRO, EX VIVO, IN VIVO
Аннотация
В статье рассмотрено – эффективное планирование и варианты проведения экспериментальных исследований с привлечением оптимального спектра методов для установления возможных направлений действия фармакологических веществ in vitro, ex vivo, in vivo. Конечной целью комплексного использования батареи методов является получение достоверных и достаточных по объему экспериментальных данных, сокращение объемов, стоимости и сроков исследования за счет грамотной разработки дизайна исследования и использования данных, полученных на каждом этапе.
Ключевые слова: скрининг, доклинические исследования, лекарственные средства, фармакологическое вещество, эффективность, безопасность, in vitro, ex vivo, in vivo.
1 Kandidat Medical Sciences, Senior Researcher, 2 Junior Researcher, 3 Junior researcher, “Institute of Pharmacy of Saint-Petersburg”
COMPLEX APPROACH TO STUDY PHARMACOLOGICAL AGENTS IN VITRO, EX VIVO, IN VIVO
Abstract
The article considers effective planning and options for experimental studies involving the optimum range of methods to identify possible areas of action of pharmacological agents in vitro, ex vivo, in vivo. The ultimate goal of the integrated use of a battery of methods to provide a reliable and sufficient in terms of experimental data, reducing the volume, cost and timing of the study by a competent study design and the use of data collected at each stage.
Keywords: screening, pre-clinical studies, drugs, pharmacological agent, the efficiency, safety, in vitro, ex vivo, in vivo.
Успешное изучение эффективности и безопасности фармакологических веществ напрямую зависит от грамотного планирования и разработки дизайна исследования. Существует большое количество методов как скрининговой, так и объемной оценки возможной направленности действия и токсических свойств фармакологических веществ. Эти методы можно условно определить в три группы согласно способам их выполнения – методы in vitro, ex vivo, in vivo.
Методы in vitro подразумевают скрининговую или объемную оценку эффективности и безопасности фармакологических веществ в модельных системах с использованием реакционных сред, ферментов, клеточных линий и др. На сегодняшний день в мировом научном сообществе методы in vitro очень популярны, как с точки зрения высокой инновационности, так и с позиции гуманного обращения с животными. Однако ограничение исследований эффективности и безопасности фармакологических веществ методами in vitro не целесообразно, так как экстраполяция полученных результатов на целый организм характеризуется высоким риском.
Методы ex vivo представляют собой, как правило, изолированные органы и ткани живых организмов. Эти методы также широко известны, а данные, полученные в результате исследований ex vivo, как правило, характеризуются большей релевантностью клинике. Однако, также как и методы in vitro, результаты исследований ex vivo, не могут являться основанием для начала клинических испытаний фармакологического вещества.
Методы in vivo являются классическими для экспериментальной фармакологии и представляют собой исследования на различных видах и линиях животных. Методы in vivo позволяют получить достоверные и достаточные по объему результаты, которые могут быть с успехом экстраполированы в клинику. Существует большое количество данных об анатомических, физиологических, биохимических и других особенностях видов и линий экспериментальных животных, которые позволяют установить степень релевантности человеку и прогнозировать результаты клинических исследований фармакологических веществ. Однако, не смотря на высокую информативность исследований in vivo, наиболее успешный подход к разработке дизайна исследований может быть обеспечен результатами исследований in vitro и ex vivo. Эти методы также позволяют существенно сократить количество животных в эксперименте, что имеет ключевое значение с точки зрения биоэтики [1,2].
В данной работе определены возможные варианты комплексной оценки эффективности фармакологических веществ с применением батареи методов in vitro, ex vivo и in vivo. Использование комплексного подхода позволяет сделать экспериментальное исследование максимально информативным и достоверным.
Комплексная оценка эффективности фармакологических веществ in vitro, ex vivo и in vivo
Для исследования эффективности фармакологических веществ особенное значение имеет скрининг фармакологической активности, пилотные исследования и изучение механизмов действия. Так, новые фармакологические вещества могут быть синтезированы или получены из природного сырья с использованием различных методов, может быть выделено большое количество стереоизомеров или веществ, отличающихся по структуре на одну или несколько функциональных групп. Проведение полноценного исследования каждого из кандидатов требует больших временных, экономических затрат и использования большого количества животных. Применение методов in vitro и ex vivo в большинстве случаев позволяет выбрать наиболее перспективные кандидаты и сократить объем исследований [3].
Исследование in vivo позволяет получить объемные данные, оптимальные для экстраполяции в клинику. Применение различных моделей заболеваний на животных, а также использование генетически модифицированных видов способствует установлению механизмов фармакологического действия, эффективных доз, динамики значений маркеров патологии при длительном курсовом применении и др.
В качестве примера приведем комплексное исследование эффективности фармакологического вещества Х, потенциально обладающего антиоксидантными и кардиопротективными свойствами, в системе методов in vitro, ex vivo и in vivo.
Дизайн исследования представлен в таблице 1.
Таблица 1 – Дизайн комплексного исследования эффективности фармакологического вещества X
На первом этапе исследования механизмов действия in vitro было установлено, что фармакологическое вещество Х характеризуется выраженной эффективностью в отношении гидроксильного радикала и перекисного окисления липидов (табл. 2).
Таблица 2 – Эффективность фармакологического вещества Х в исследованиях in vitro
Эффективность фармакологического вещества Х превышала таковую препарата сравнения Y.
Установлено, что наличие антиоксидантных свойств фармакологического вещества обусловливает его цитопротекторные свойства [4]. В многочисленных клинических и экспериментальных исследованиях определено, что оксидативный стресс играет ключевую роль в развитии кардиоваскулярных патологий, таких как ИБС, АГ, атеросклероз, коронарная недостаточность и сердечная недостаточность [5,6].
Результаты исследований in vitro позволили определить основные направления экспериментального дизайна ex vivo и in vivo, а также установить возможные механизмы действия фармакологического вещества.
Вторым этапом исследований было определение кардиопротекторных свойств фармакологического вещества Х в эксперименте ex vivo, проведенном на изолированном сердце по методу Лангендорфа [7]. Исследование проводили при применении фармакологического вещества Х в трех дозах.
В результате второго этапа исследований было установлено, что значения показателей давления (LVP) и скорости сокращения (dP/dt max) левого желудочка на фоне ишемии с последующей реперфузией изолированного сердца статистически значимо увеличиваются, что может свидетельствовать о положительном инотропном действии препарата (рис. 1).
Рис. 1 – Эффективность фармакологического вещества Х в исследовании ex vivo.
Данные, полученные в исследовании in vitro и ex vivo, дают основание предполагать ключевой механизм действия и фармакологический эффект вещества, а, следовательно, планировать эксперименты in vivo.
Таким образом, так как in vitro и ex vivo фармакологическое вещество X характеризовалось выраженной кардиопротекторной активностью, а также влиянием на антиоксидантную систему, то для изучения специфической активности in vivo были выбраны модели сердечно-сосудистых патологий, патогенез которых связан с оксидативным стрессом и нарушением сократимости миокарда: острый инфаркт миокарда и артериальная гипертензия.
В результате исследований эффективности фармакологического вещества Х in vivo на модели острого инфаркта миокарда было установлено влияние на физиологические и биохимические параметры моделируемой патологии (табл. 3).
Таблица 3 – Эффективность фармакологического вещества Х на фоне моделирования острого инфаркта миокарда у крыс, M ± m.
Примечание – * p ‹ 0,05 в сравнении контрольной группой
В результате исследований эффективности фармакологического вещества Х in vivo у спонтанно-гипертензивных крыс наблюдали выраженное снижение систолического (САД) и диастолического (ДАД) артериального давления как до применения фармакологического вещества Х, так и через 1 час после (табл. 4).
Таблица 4 – Изменение АД при курсовом применении фармакологического вещества Х
Примечание – * p ‹ 0,05 в сравнении контрольной группой
Таким образом, в результате использования комплексной оценки in vitro, ex vivo и in vivo была установлена высокая эффективность нового фармакологического вещества Х и определены возможные механизмы действия. На модели изолированного сердца по методу Лангендорфа и при моделировании острого экспериментального инфаркта миокарда in vivo было установлено кардиотоническое и кардиопротективное действие препарата. При применении нового препарата у спонтанно-гипертензивных животных наблюдалось стойкое снижение АД, а также уменьшение цифр исходного давления к концу курса лечения. Было установлено, что ключевую роль в реализации фармакологических эффектов фармакологического вещества Х играет его антиоксидантная активность, что было подтверждено в исследованиях антирадикальной и восстанавливающей способности in vitro.
Использование методов in vitro и ex vivo позволило существенно сократить объем экспериментальных животных, так как на основании их результатов были выбраны эффективные дозы фармакологического вещества Х и наиболее подходящие экспериментальные модели.