Избыточное время флотации приводит к чему в гистологии
Избыточное время флотации приводит к чему в гистологии
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ
ДАГЕСТАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
Предметом изучения цитологии, гистологии и эмбриологии являются клеточно-тканевые структуры организмов на микроскопическом уровне, а предметом изучения – микроскопический препарат. Поэтому для успешного освоения этих наук необходимо владеть гистологической техникой – приемами и методами изготовления микроскопических препаратов и способами их изучения. В настоящем руководстве изложены основные сведения по технике гистологических исследований, оно знакомит студентов с правилами работы и методами наблюдения под микроскопом, методикой приготовления препаратов. Особое внимание уделено методам окрашивания различных клеточно-тканевых структур и гистохимическим исследованиям. Методики применимы на растительных и животных объектах.
Методические указания рекомендованы для студентов, специализирующихся по кафедре физиологии человека и животных, могут быть использованы на лабораторных занятиях по цитологии, гистологии и эмбриологии, большом практикуме, при выполнении курсовых и дипломных работ.
Автор: Газимагомедова И.К. – доц. каф. зоологии и физиологии, канд. биол. наук
Приготовление постоянного микротомного препарата Взятие и фиксация материала …………………………….
Уплотнение (заливка в парафин) ………………………….
Окрашивание и заключение в бальзам ………………….
Методы окрашивания гистологических препаратов …
Методы окраски клеток и неклеточных структур соединительной ткани ……………………………………..
Выявление элементов нервной системы
Приготовления препаратов давленных объектов. Методы изучения митоза и мейоза ………………………
1. Световая Микроскопия
1.1. Устройство микроскопа
В микроскопе различают оптическую (объектив, окуляр), осветительную (источник света, зеркало, конденсор и диафрагма) и механическую (штатив, предметный столик, колонка с макро- и микровинтами, тубус) части (рис. 1).
Рис.1. Световой микроскоп.
Полное увеличение микроскопа оценивают как произведение увеличений объектива и окуляра, например, при объективе 
20 и окуляре 10 полное увеличение микроскопа будет 200 (20 10 = 200 раз).
Разрешающая способность объектива, т.е. минимальное расстояние между двумя видимыми точками (минимальный размер объекта):
где: λ – длина волны света, используемого для освещения объекта; n – коэффициент преломления среды (воздух или масло); α – угол между оптической осью объектива и наиболее отклоняющимся лучом, попадающим в объектив (максимально 90°); n ∙ sin α – апертура линз.
Если использовать ультрафиолетовый свет (260 – 280 нм), то можно повысить разрешение до 130-140 нм (0,13 – 0,14 мкм). Это будет пределом теоретического разрешения светового микроскопа, определяемым волновой природой света. Таким образом, все, что может дать световой микроскоп как вспомогательный прибор к нашему глазу – это повысить разрешающую способность его примерно в 1000 – 2500 раз. Это и есть “полезное” увеличение микроскопа, выше которого мы будем только увеличивать контуры изображения, не открывая в нем новых деталей. Следовательно, при использовании видимой области света 0,2–0,3 мкм является конечным пределом разрешения светового микроскопа (минимальное расстояние на котором различимы два объекта).
Зеркало собирает лучи от источника света и направляет их на препарат снизу. При искусственном освещении используется вогнутая поверхность зеркала, а при дневном – плоская.
Конденсор состоит из линз, которые фокусируют лучи света на препарате. Поднимая и опуская конденсор (с помощью винта), можно настраивать фокусировку лучей. При подъеме конденсора попадающие на препарат лучи рассеиваются, при опускании концентрируются на препарате, но на более ограниченном участке. Обычно работают при конденсоре, поднятом до уровня столика.
В итоге, световые лучи проходят следующий путь: источник света → зеркало → конденсор → диафрагма → препарат → объектив → тубус → окуляр. Т.е. микроскопия ведётся в проходящем свете, для чего препарат должен быть достаточно тонким.
1.2. Техника микроскопирования
Изучить препарат при малом увеличении.
Перевести препарат на большое увеличение. Для этого сменяют объектив на 
40 поворотом для револьвера. Медленно и осторожно опускают тубус почти до касания объективом покровного стекла (до образования узкой щели), чтобы не раздавить стекла. Медленно вращая микровинт на пол-оборота вперед или назад, достигается четкость изображения. На микровинт бывает надето кольцо с делениями, показывающими, на сколько микрон мы поднимаем или опускаем тубус. На левом барабанчике этого винта нанесено 50 делений, и каждое перемещение на одно деление соответствует 2 микронам. Эти деления также позволяют оценить толщину препарата и определить, на какой относительной глубине залегают те или иные структуры в срезе, например, каков слой цитоплазмы над или под ядром, каков размер последнего.
Для изучения очень мелких структур используют иммерсионный объектив ( 90). При этом на покровное стекло препарата наносят каплю иммерсионной среды (бывают масляные, водные, глицериновые), обычно кедровое масло, затем осторожно опускают тубус до соприкосновения линзы объектива с маслом. Четкость изображения регулируют микровинтом. После работы удаляют марлей иммерсионное масло с объектива и покровного стекла.
2. Приготовление постоянного микротомного препарата
Приготовление постоянных гистологических препаратов включает следующие этапы: 1) взятие и фиксация материала; 2) промывка и обезвоживание; 3) уплотнение (заливка в парафин); 4) приготовление срезов; 5) окрашивание; 6) обезвоживание и заключение препаратов в консервирующую среду (рис. 2).
2.1. Взятие и фиксация материала
Необходимое условие при взятии материала – сохранение прижизненной организации тканей. Для этого материал берут «живьем» и быстро убивают, обычно погружая в специальные фиксирующие жидкости, в целях сохранения витальной структуры, т.е. проводят фиксацию.
Рис. 2. Этапы приготовления гистологического препарата для световой микроскопии.
В зависимости от строения органа взятие материала осуществляется по-разному. Из однородных органов (печень, селезенка) кусочек можно вырезать из любого участка. Из неоднородных органов (почка, надпочечник) необходимо так вырезать кусочек, чтобы попали все слои. Величина кусочка зависит от структуры органа, целей исследования и способов дальнейшей обработки. Из соответствующего органа вырезают обычно небольшие кусочки (0,5 x 1 x 1 см ).
Способы фиксации – использование фиксирующих жидкостей, криофиксация (мгновенное замораживание в жидком азоте) и лиофилизация (замораживание с последующим высушиванием в вакууме). При лиофилизации выпадает необходимость проводить обезвоживание и уплотнение материала.
Фиксирующие средства бывают простые и сложные. К первым относятся спирты, ацетон, кислоты, формалин, сулема, пикриновая кислота, тетраоксид осмия. Сложными являются смеси различных веществ, например жидкость Ценкера, жидкость Карнуа, жидкость Буэна и т.д. Так, для лучшей фиксации ядер употребляют хромовые или хромосмиевые смеси, для фиксации цитоплазмы смеси Карнуа или Буэна. Фиксирующие свойства зависят от рН среды, температуры, продолжительности фиксации.
В последнее время, особенно для электронной микроскопии, широко используется глютаровый альдегид, который более эффективно сшивает молекулы и тем самым обладает сильным фиксирующим действием.
Требования, предъявляемые к фиксатору : 1) свежесть; 2) достаточное количество. Объем фиксатора должен в 20-40 раз превышать объем фиксируемого материала, объект со всех сторон должен быть окружен фиксатором. Если часть материала плавает на поверхности фиксатора, то сверху накладывают тонкий слой ваты. Как до, так и после фиксации объект не должен подсыхать на воздухе.
100% или 96% спирт……………………6 частей
Ледяная уксусная кислота…………… 1 часть
Фиксатор готовят перед употреблением. Фиксируют от 30 мин до 3 ч, затем кусочки можно хранить в 70% спирте.
100% или 96% этиловый спирт………. 3 части
Продолжительность фиксации – 2-12 ч. Иногда в нем хранят материал при 0-3 о С.
Двухромовокислый калий………………2,5 г
Сернокислый натрий…………………….1 г
Дистиллированная вода…………………100 мл
Ледяная уксусная кислота………………5 мл (добавляют перед употреблением)
Фиксируют 1-24 ч. Затем 24 ч промывают в водопроводной воде до обесцвечивания воды. Материал обесцвечивают в 70% спирте, где его можно хранить. Цвет фиксатора – насыщенно красно-бордовый. Как только сулема будет удалена, раствор перестанет обесцвечиваться.
100% или 96% спирт…………………….10 мл
Ледяная уксусная кислота………………2 мл
Фиксируют от 5 мин и более. Фиксатор пригоден для приготовления временных давленых препаратов.
5% формалин: 1 часть 40% формалина + 7 частей дистиллированной воды.
10% формалин: 1 часть 40% формалина + 3 части дистиллированной воды.
20% формалин: 1 часть 40% формалина + 1 часть дистиллированной воды.
Методика проведения фиксации. Берется чистая стеклянная посуда (пробирки, бюксы или стаканчики) с фиксатором, объем которого в 20-40 раз больше объема материала. На дно посуды кладут гигроскопическую или стеклянную вату для равномерного пропитывания объекта. Материал с помощью пинцета быстро помещается в фиксирующую смесь (фиксатор должен быстро проникать в ткани и не вызывать грубых нарушений тканевых структур) и посуда плотно закрывается. Вместе с материал в пробирку кладется фиксационная этикетка, сделанная из плотной бумаги, размером 1х1 см, на которой простым карандашом отмечаются название изучаемого материала, фиксатора и дата фиксации.
Если ткань богата водой или кровью, фиксатор следует дважды сменить.
После фиксации образцы промывают проточной водой (в некоторых случаях спиртом) от 1 до 3 ч, иногда дольше. Промывкой материала удаляется излишнее количество фиксатора. В зависимости от способа фиксации существуют разные способы промывки. После фиксации в смеси с пикриновой кислотой промывка производится 70-80% спиртом. При фиксации в смесях, содержащих сулему, трихлоруксусную кислоту, используют 90-96% спирт. При формалиновой фиксации и фиксации хромовыми смесями промывку производят проточной водой под краном, или неоднократной сменой воды (10-12 раз) в течение 24-48 ч. Материал, фиксированный в смесях с преобладанием спирта (фиксатор Карнуа) промывке не подвергается.
Существуют разные приспособления для промывки: 1) обычные стеклянные склянки с пробкой или завязанные марлей и резиновым шлангом, соединенные с краном; 2) для мелких объектов применяются специальные фарфоровые сита; 3) стеклянные трубочки, обвязанные с обеих сторон марлей.
Удобно провести промывку материала следующим образом: материал вместе с этикеткой переносят в марлевые узелки, перевязывают их ниткой и помещают в высокий стакан с водой. Сверху в стакан кладут воронку и все ставят под кран с проточной водой.
Далее необходимо получить срезы материала для их последующего окрашивания. Для этого образцы уплотняют, т.е. заливают в парафин или целлоидин, чтобы в последующем их можно было тонко резать. Предварительно образцы обезвоживают, чтобы гидрофобный уплотнитель смог проникнуть в ткань. Обезвоживание производится проведением материала по батарее спиртов возрастающей концентрации, что позволяет избежать разрывов и деформаций ткани.
Методика обезвоживания. Материал вынимают из марлевых узелков и вместе с этикеткой последовательно помещают в стаканчики или бюксы со спиртами (метанол или этанол) возрастающей концентрации – 70%, 80%, 96%, 100%. Чем нежнее материал, тем ниже первоначальная концентрация спирта (начинают с 20% спирта). Время выдерживания в каждом спирте зависит от толщины материала и строения органа: от 30 мин, 1-6 ч, и до 6-12 ч. В 96% и 100% спиртах выдерживают дважды. При перекладывании материала из слабого раствора спирта в спирт большей концентрации кусочки необходимо обсушить фильтровальной бумагой.
Схема и сроки выдерживания в спиртах растительного материала:
Гистология
Гистология – это раздел науки, который изучает строение, жизнедеятельность и развитие тканей организма человека или животных. Каждая ткань в организме человека имеет определенную структуру, характерные признаки и особенности, а любое отклонение от нормы является патологией. Для выявления различных нарушений в состоянии тканей организма применяется гистологическое исследование.
Показания для гистологии
Анализ тканей организма проводится во многих областях медицины, но лучшей информативностью и ценностью данный метод обладает при анализе тканей различных новообразований. Гистология позволяет определить характер опухоли (доброкачественный или злокачественный), скорость увеличения ее размеров, степень дифференцировки клеток (насколько атипичные клетки отличаются от здоровых). Данные исследования позволяет составить эффективную схему лечения и контролировать его результаты, при необходимости вносить изменения в терапию.
Гистологические исследования широко используются во всех разделах медицинской практики – гинекологии, гастроэнтерологии, нефрологии, пульмонологии, урологии, дерматологии, оториноларингологии и других. Помимо диагностики различных новообразований, гистология применяется для дифференциации воспалительных процессов, происходящих в тканях.
Как проводится гистологический анализ?
Гистологическое исследование в медицинской практике – это забор и последующее изучение биоматериала. В данном случае для анализа берутся образцы тканей организма, которые вызывают вопросы у врача.
Гистологическому исследованию предшествует процедура биопсии, при которой врач производит забор биоптата для исследования. Методика проведения биопсии отличается в зависимости от расположения исследуемого участка. Забор биоматериала может производиться несколькими способами:
Биопсия может быть инцизионной, материал для которой врач берет во время хирургической операции. Для исследования берется часть пораженной ткани. Гистологическое исследование обязательно проводится после удаления органа или новообразования.
Этапы гистологического исследования
Результаты гистологического анализа готовы на 7-10 день, при исследовании биоматериалов костной ткани заключение будет готово только спустя две недели.
Противопоказания для проведения исследования
Противопоказания для проведения гистологии очень мало. Как правило, противопоказанием является нарушение свертываемости крови и аллергия на анестетики (это не позволит провести забор биоматериала). Биопсия не берется, если есть риск прерывания беременности, при сердечной недостаточности, а также у маленьких детей.
Что показывает гистология?
В процессе гистологического исследования проводится подробный анализ ткани, определяется ее цвет, плотность и консистенция. Описываются обнаруженные патологические изменения в ткани и клетках. В бланке с результатом гистологии указывается вид исследуемых тканей, наличие атипичных клеток, их вид, есть ли злокачественные клетки, есть ли нарушения структуры ткани, наличие воспалительного процесса и другие особенности.
Данные гистологического исследования может оценить только специалист, поэтому, даже получив заключение на руки, не спешите сами ставить себе диагноз и тем более назначать лечение. Лучше в этом вопросе обратиться за квалифицированной помощью.
В многопрофильном медицинском центре «Longa Vita» проводятся гистологические исследования гинекологического профиля, а также анализы новообразований кожи, подкожно-жировой клетчатки, молочной и щитовидной желез, простаты, печени, почек и др. Наш центр специализируется на ранней диагностике рака и у нас работают высококвалифицированные врачи онкологи с многолетним опытом работы в данной области.
Гистологические исследования. Особенности диагностики
В Морозовской больнице проводится весь спектр исследований биопсийного и операционного материала. Ежегодно исследуется материал почти 20 тысяч человек. В их числе пациенты Морозовской больницы, городских детских стационаров и поликлиник, акушерских стационаров.
По словам заведующего патологоанатомическим отделением Морозовской ДГКБ Алексея Николаевича Кислякова, в основе патоморфологических (гистологических) исследований лежит изучение изменений, происходящих в тканях, при помощи микроскопа. Врачами анализируется биопсийный материал, получаемый исключительно в диагностических целях.
Это могут быть фрагменты ткани пациента (кожи, слизистых оболочек, внутренних органов, костей, мягких тканей, головного и спинного мозга). Кроме того, обязательному исследованию подлежит операционный материал, т. е. все то, что удаляется во время операции (орган или его часть, опухоль).
В отделении проводится прижизненная диагностика широкого спектра детских болезней. Особое место занимают онкологические случаи.
«Мы анализируем фрагменты тканей, полученные с помощью биопсии или изъятые во время операции. Например, при проведении гастро- и колоноскопии, удалении аппендицита или патологическом родоразрешении исследования позволяют подтвердить диагноз на микроскопическом уровне. Если говорить об онкологии, которая является авангардом морфологической службы, то диагностика с учетом общей клинической картины, лабораторных и параклинических данных (КТ, МРТ) позволяет быстро и точно не только определить наличие патологии, но уточнить ее конкретный вид и индивидуальные характеристики. А от этого зависит, насколько точно будет поставлен диагноз и назначено эффективное лечение», — отметил Алексей Кисляков.
Для того чтобы специалист смог увидеть и проанализировать микроскопическую картину ткани, образец проходит специальную подготовку. Сначала врач-патологоанатом оценивает его макроскопически: измеряет, описывает внешний и внутренний вид (размер, цвет, плотность, структуру). После этого происходит вырезка, при которой врач отбирает определенные фрагменты пораженного органа или опухоли для гистологического исследования.
Лабораторный процесс преаналитического этапа гистологического исследования осуществляется в автоматизированном режиме на современном оборудовании. Процесс подготовки подразумевает поочередное выполнение следующих действий:
Полученные после обработки материала гистологические препараты врач анализирует и описывает. Благодаря конференц-микроскопу существует возможность одновременного совместного просмотра образцов несколькими специалистами. Кроме того, наличие сканера гистологических препаратов позволяет проводить дистанционное консультирование биопсийного и операционного материала, в том числе, иностранными коллегами.
«При диагностике доброкачественных и злокачественных новообразований, когда постановка диагноза с помощью рутинных гистологических исследований невозможна или требуется уточнение важных иммунофенотипических параметров опухоли, в патологической анатомии применяется дополнительный метод исследования — иммуногистохимия. Она является составной частью гистологического исследования и проводится на том же материале. Иммуногистохимическое исследование позволяет определить гистогенез (происхождение) опухоли, установить ее конкретную нозологическую форму, оценить ее пролиферативный потенциал, то есть, степень возможного роста. В ряде случаев также определяют антигены-таргеты, которые являются «мишенями» для специфической терапии»,- отметил доктор медицинских наук, профессор, врач-патологоанатом Морозовской ДГКБ Александр Гаврилович Талалаев.
Некоторые злокачественные образования требуют также генетического подтверждения. В таком случае проводится флуоресцентная гибридизация in situ (FISH-тест). С ее помощью в анализируемом образце ткани можно выявить генетические аномалии, позволяющие отличить один вид опухоли от другой и выделить маркеры, отвечающие за лекарственную чувствительность опухоли.
Завершающим этапом является формирование заключения, то есть гистологического диагноза. Если речь идет об онкологии, заключение формулируется строго в соответствии с Международной классификацией онкологических заболеваний Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ). Классификатор состоит из нескольких томов по каждому разделу онкологии. Он регулярно обновляется, дополняется и уточняется.
В патологоанатомическом отделении, которое существует со дня основания Морозовской больницы, работают высококвалифицированные специалисты: врачи-патологоанатомы, лаборанты. Все специалисты обладают экспертными компетенциями и накопленным опытом проведения исследований, от которых зависит точность поставленного диагноза и эффективность назначенного лечения.