какие культуральные признаки учитывают при идентификации бактерий

Признаки, учитываемые при идентификации микроорганизмов (критерии вида)

тинкториальные свойства: окраска по Граму или другими дифференциально-диагностическими методами

рост на плотных (вид колоний) и в жидких средах

оксидоредуктаз(оксидазы, каталазы, дегидраз)

ферментов-токсинов (гемолизинов, плазмокоагулазы, лецитиназы, гиалуронидазы, ДНК-азы)

экзотоксинов(дифтерийного и др.)

профиля летучих жирных кислот(для анаэробов)

содержание Г+Ц (%) в ДНК

последовательность нуклеотидов в ДНК и РНК

изучение антигенной структуры микроба и определение его серовара в РА на стекле с моновалентными сыворотками или в реакции латекс-агглютинации

вирулентность для животных

чувствительность к бактериофагам (определение фаговара)

чувствительность к антибиотикам

(естественное место обитания)

4 Этап.

А. Учет и анализ результатов. Учитывают результаты изучения биохимических, серологических, генетических и др. характеристик и сравнивают их со свойствами эталонных (типовых) штаммов различных видов микроорганизмов. Относят идентифицируемый микроорганизм к тому виду, с которым он проявляет наибольшее сходство. Учитывают спектр чувствительности к противомикробным препаратам.

Б. Выдача заключения. Оформляют заключение, которое представляет собой заверенный бланк с данными о пациенте, исследованном материале, выделенных видах микроорганизмов (в случае выделения УПМ необходимо указывать количество), спектре их чувствительности к противомикробным препаратам.

II. Этапы блми при выделении чистой культуры облигатных анаэробов.

Среди облигатных анаэробов выделяют спорообразующие анаэробы клостридии (возбудители ботулизма, столбняка, газовой гангрены) и неспорообразующие (неклостридиальные)  пептококки, пептострептококки, вейлонеллы, пропионобактерии, бактероиды, порфиромонады, превотеллы, фузобактерии.

1 Этап.

А. Забор материала и транспортировка с использованием транспортных систем для анаэробов.

Б. Микроскопическое исследование материала (в материале присутствуют полиморфные микроорганизмы, либо грубые грамположительные палочки с обрубленными концами).

В. Предварительная обработка материала методами температурного или алкогольного шока для выделения спорообразующих анаэробов.

Процедура алкогольного шока: в течение 1 часа при комнатной температуре (2225 0 С) при постоянном перемешивании выдерживают смесь равных объемов абсолютного (или 96%) этилового спирта и исследуемого материала (суспензия фекалий, раневой экссудат).

Процедура теплового шока: в подогретую на водяной бане при 80 0 С в течение 5 минут пробирку со средой из рубленого мяса с глюкозой и крахмалом (chopped meat-glucose-starch medium) добавляют 1 мл суспензии соответствующего образца. Экспонируют пробу в течение 10 минут, а затем извлекают пробирку и охлаждают перед посевом в холодной воде.

Г. Посев материла на анаэробный кровяной агар и на элективные, дифференциально-диагностические среды (анаэробный кровяной агар с гентамицином или анаэробный кровяной агар с неомицином и налидиксовой кислотой) с целью получения изолированных колоний. Посевы инкубируют 2448 часов при 37 0 С в анаэробных условиях (в анаэробной камере, либо в микроанаэростате, либо в анаэробном пакете).

Д. Посев материла в жидкую тиогликолевую среду с целью определения летучих жирных кислот.

Источник

7.1. Принципы культивирования и идентификации бактерий

Микроорганизмы (за исключением облигатных внутриклеточных паразитов— риккетсий, хламидий, вирусов и простейших) культивируют, как правило, на искусственных питательных средах. В зависимости от пищевых потребностей того или другого вида питательные среды должны содержать соответствующие исходные вещества, необходимые для пластического и энергетического метаболизма.

Выделение микроорганизмов из различных материалов и получение их культур широко используется в лабораторной практике для микробиологической диагностики инфекционных заболеваний, в научно-исследовательской работе и в микробиологическом производстве вакцин, антибиотиков и других биологически активных продуктов микробной жизнедеятельности.

Условия культивирования также зависят от свойств соответствующих микроорганизмов. Большинство патогенных микробов выращивают на питательных средах при температуре 37°С в течение 12 сут. Однако некоторые из них нуждаются в более длительных сроках. Например, бактерии коклюша— в 2-3 сутках, а микобактерии туберкулеза — в 3—4 неделях.

Для стимуляции процессов роста и размножения аэробных микробов, а также сокращения сроков их выращивания используют метод глубинного культивирования, который заключается в непрерывном аэрировании и перемешивании питательной среды. Глубинный метод нашел широкое применение в биотехнологии.

Для культивирования анаэробов применяют особые методы, сущность которых заключается в удалении воздуха или замены его инертными газами в герметизированных термостатах — анаэростатах. Анаэробов выращивают на питательных средах, содержащих редуцирующие вещества (глюкозу, муравьинокислый натрий и др.), уменьшающие окислительно-восстановительные потенциал.

В диагностической практике особое значение имеют чистые культуры бактерий, которые выделяются из исследуемого материала, взятого у больного или объектов окружающей среды. С этой целью используют искусственные питательные среды, которые подразделяют на основные, дифференциально-диагностические и элективные самого разнообразного состава. Выбор питательной среды для выделения чистой культуры имеет существенное значение при бактериологической диагностике.

В большинстве случаев используют твердые питательные среды, предварительно разлитые в чашки Петри. На поверхность среды петлей помещают исследуемый материал и растирают шпателем, чтобы получить изолированные колонии, выросшие из одной клетки. Пересев изолированной колонии на скошенную агаровую среду в пробирку приводит к получению чистой культуры.

Для идентификации, т.е. определения родовой и видовой принадлежности выделенной культуры, чаще всего изучают фенотипические признаки:

а) морфологию бактериальных клеток в окрашенных мазках, либо нативных препаратах;

б) биохимические признаки культуры по ее способности ферментировать углеводы (глюкоза, лактоза, сахароза, мальтоза, маннит и др.), образовывать индол, аммиак и сероводород, являющиеся продуктами протеолитической активности бактерий.

Для более полного анализа применяют газово-жидкостную хромографию и другие методы.

Наряду с бактериологическими методами для идентификации чистых культур широко используют иммунологические методы исследования, которые направлены на изучение антигенной структуры выделенной культуры. С этой целью используют серологические реакции: агглютанации, преципитации иммунофлюоресценции, связывания комплемента, иммуноферментный, радиоиммунный методы и др.

Методы выделения чистой культуры

Для того, чтобы выделить чистую культуру микроорганизмов, следует отделить многочисленные бактерии, которые находятся в материале, одна от другой. Это можно достичь с помощью методов, которые основаны на двух принципах – механическом и биологическом разобщении бактерий.

Методы выделения чистых культур, основанные на механическом принципе

Метод последовательных разведений, предложен Л. Пастером, был одним из самых первых, который применялся для механического разъединения микроорганизмов. Он заключается в проведении последовательных серийных разведений материала, который содержит микробов, в стерильной жидкой питательной среде. Этот прием достаточно кропотлив и несовершенный в работе, поскольку не позволяет контролировать количество микробных клеток, которые попадают в пробирки при разведениях.

Этого недостатка не имеет метод Коха (метод пластинчатых разведений). Р. Кох использовал плотные питательные среды на основе желатина или агар-агара. Материал с ассоциациями разных видов бактерий разводился в нескольких пробирках с растопленным и немного охлажденным желатином, содержание которого позже выливалось на стерильные стеклянные пластины. После застудневания среды оно культивировалось при оптимальной температуре. В его толще образовывались изолированные колонии микроорганизмов, которые легко могут быть перенесены на свежую питательную среду с помощью платиновой петли для получения чистой культуры бактерий.

Метод Дригальского является более совершенным методом, который широко распространен в повседневной микробиологической практике. Сначала на поверхность среды в чашке Петри пипеткой или петлей наносят исследуемый материал. С помощью металлического или стеклянного шпателя его тщательным образом втирают в среду. Чашку во время посева держат открытой и осторожно вращают, чтобы равномерно распределить материал. Не стерилизуя шпателя, проводят им занял материалу в другой чашке Петри, при потребности – в третьей. Только после этого шпатель окунают в дезинфицирующий раствор или прожаривают в пламени горелки. На поверхности среды в первой чашке наблюдаем, как правило, сплошной рост бактерий, во второй – густой рост, а в третьей – рост в виде изолированных колоний.

Колонии по методу Дригальского

Метод штриховых посевов сегодня используется в микробиологических лабораториях чаще всего. Материал, который содержит микроорганизмы, набирают бактериологической петлей и наносят на поверхность питательной среды возле края чашки. Снимают избыток материала и проводят занял его параллельными штрихами от края к краю чашки. Спустя сутки инкубации посевов при оптимальной температуре на поверхности чашки вырастают изолированные колонии микробов.

Для получения изолированных колоний можно использовать занял тампоном, которым проводили забор исследуемого материала. Несколько преоткрывают чашку Петри с питательной средой, вносят туда тампон и осторожными движениями втирают материал в поверхность чашки, возвращая постепенно тампон и чашку.

Таким образом, существенное преимущество методов пластинчатых разведений Коха, Дригальского и штриховых посевов заключается в том, что они создают изолированные колонии микроорганизмов, которые при инокуляции на другую питательную среду превращаются в чистую культуру

Методы выделения чистых культур, основанные на биологическом принципе

Биологический принцип разъединения бактерий предусматривает целеустремленный поиск методов, которые учитывают многочисленные особенности микробных клеток. Среди самых распространенных методов можно выделить следующие:

1. По типу дыхания. Все микроорганизмы по типу дыхания разделяются на две основных группы: аэробные (Corynebacterium diphtheriae, Vibrio сholerae и тому подобное) и анаэробные (Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens и др.). Если материал, из которого следует выделить анаэробные возбудители, предварительно прогреть, а затем культивировать в анаэробных условиях, то вырастут именно эти бактерии.

2. По спорообразованию. Известно, что некоторые микробы (бациллы и клостридии) способны к споротворення. Среди них Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Bacillus subtilis, Bacillus cereus. Споры стойкие к действию факторов внешней среды. Следовательно, исследуемый материал может быть подданный действию термического фактора, а затем инокулятивно перенесен в питательную среду. Спустя некоторое время на нем вырастут именно те бактерии, которые способны к споротворению.

3. Стойкость микробов к действию кислот и щелочей. Некоторые микробы (Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis) в результате особенностей их химического строения стойки к действию кислот. Вот почему материал, который их содержит, например, мокрота при туберкулезе предварительно обрабатывают равным объемом 10 % раствора серной кислоты, а затем высевают на питательные среды. Посторонняя флора погибает, а микобактерии в результате их резистентности к кислотам, вырастают.

Холерный вибрион (Vibrio сholerae), напротив, является галофильной бактерией, потому для создания оптимальных условий роста его высевают на среды, которые содержат щелочь (1 % щелочная пептонная вода). Уже через 4-6 часов на поверхности среды появляются характерные признаки роста в виде нежной голубоватой пленки.

4. Подвижность бактерий. Некоторые микробы (Proteus vulgaris) имеют тенденцию к ползучему росту и способны быстро распространяться по поверхности кое-что влажной среды. Для выделения таких возбудителей их засевают в капельку конденсационной жидкости, которая образуется при охлаждении столбика скошенного агара. Через 16-18 год они распространяются на всю поверхность среды. Если взять материал из верхней части агара, будем иметь чистую культуру возбудителей.

5. Чувствительность микробов к действию химических веществ, антибиотиков и других противомикробных средств. В результате особенностей метаболизма бактерий они могут иметь разную чувствительность к некоторым химическим факторам. Известно, что стафилококки, аэробные бациллы, которые образуют споры, стойкие к действию 7,5–10 % хлорида натрия. Вот почему для выделения этих возбудителей используют элективные питательные среды (желточно-солевой агар, манит-солевой агар), которые содержат именно это вещество. Другие бактерии при такой концентрации хлорида натрия практически не растут.

7. Способность микроорганизмов проникать через неповрежденные кожные покровы. Некоторые патогенные бактерии (Yersinia pestis) в результате наличия большого количества ферментов агрессии способны проникать через неповрежденную кожу. Для этого шерсть на теле лабораторного животного бреют и в этот участок втирают исследуемый материал, который содержит возбудителя и большое количество сторонней микрофлоры. Через некоторое время животное забивают, а из крови или внутренних органов выделяют микробов.

8. Чувствительность лабораторных животных к возбудителям инфекционных заболеваний. Отдельные животные проявляют высокую чувствительность к разным микроорганизмам.

Например, при любом способе введения Streptococcus pneumoniae белым мышам у них развивается генерализованная пневмококковая инфекция. Аналогичная картина наблюдается при заражении гвинейских свинок возбудителями туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis).

В повседневной практике бактериологи пользуются такими понятиями как штамм и чистая культура микроорганизмов. Под штаммом понимают микробов одного вида, которые выделены из разных источников, или из одного и того же источника, но в разное время. Чистая культура бактерий – это микроорганизмы одного вида, потомки одной микробной клетки, которые выросли на (в) питательной среде.

Выделение чистой культуры аеробних микроорганизмов состоит из ряда этапов.

Однако, порой с целью нагромождения материала его засевают на жидкие питательные среды.

На второй день (2 этап исследования) на поверхности плотной питательной среды микроорганизмы образуют сплошной, густой рост или изолированные колонии. Колония – это видимые невооруженным глазом скопления бактерий на поверхности или в толще питательной среды. Как правило, каждая колония формируется из потомков одной микробной клетки (клоны), потому их состав достаточно однороден. Особенности роста бактерий на питательных средах являются проявлением их культуральных свойств.

Чашки тщательным образом рассматривают и изучают изолированные колонии, которые выросли на поверхности агара. Обращают внимание на величину, форму, цвет, характер краев и поверхности колоний, их консистенцию и другие признаки. Если требуется, исследуют колонии под лупой, малым или большим увеличением микроскопа. Структуру колоний исследуют в проходном свете при малом увеличении микроскопа. Они могут быть гиалиновые, зернистые, нитевидные или волокнистые, которые характеризуются наличием переплетенных нитей в толще колоний.

Характеристика колоний – важна составная часть работы бактериолога и лаборанта, ведь микроорганизмам каждого вида присущи свои особенные колонии.

На третий день (3 этап исследования) изучают характер роста чистой культуры микроорганизмов и проводят ее идентификацию.

Сначала обращают внимание на особенности роста микроорганизмов на среде и делают мазок, крася его методом Грама, с целью проверки культуры на чистоту. Если под микроскопом наблюдают бактерии однотипной морфологии, размером и тинкториальных (способность краситься) свойств, делают вывод, что культура чиста. В некоторых случаях уже по внешнему виду и особенностям их роста можно сделать вывод о виде выделенных возбудителей. Определение вида бактерий по их морфологическим признакам называется морфологической идентификацией. Определения вида возбудителей по их культуральным признакам называют культуральной идентификацией.

Однако этих исследований недостаточно, чтобы сделать окончательный вывод о виде выделенных микробов. Потому изучают биохимические свойства бактерий. Они достаточно разнообразны.

Определение вида возбудителя по его биохимическим свойствам называется биохимической идентификацией.

С целью установления видовой принадлежности бактерий часто изучают их антигенное строение, то есть проводят идентификацию по антигенным свойствам. Каждый микроорганизм имеет в своем составе разные антигенные субстанции. В частности, представители семьи энтеробактерий (ешерихии, сальмонели, шигелы) содержат оболочковый О-антиген, жгутиковий Н-антиген и капсульный К-антиген. Они неоднородны своим химическим составом, потому существуют во многих вариантах. Их можно определить с помощью специфических аглютинуючих сывороток. Такое определение вида бактерий носит название серологической идентификации.

Иногда идентификацию бактерий проводят, заражая лабораторных животных чистой культурой и наблюдая за теми изменениями, которые вызывают возбудители в организме (туберкулез, ботулизм, столбняк, сальмонеллез и тому подобное). Такой метод называют идентификацией по биологическими свойствам. Как объекты – чаще всего используют гвинейских свинок, белых мышей и крыс.

Источник

Тема 3.2. Идентификация бактерий

Введение. Идентификация — определение (установление) ви­довой принадлежности микроба. В настоящее время общепри­нятый метод идентификации основан на изучении определен­ного набора наиболее важных фенотипических признаков ис­следуемого микроорганизма. Критерием для идентификации является наличие у микроба совокупности основных призна­ков, характерных для данного вида (таксонометрических при­знаков). Установление вида производится согласно междуна­родной таксономии бактерий (Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology).

К основным видовым признакам бактерий относятся:

морфология микробной клетки;

тинкториальные свойства — особенности окрашивания с помощью простых и сложных методов окраски;

культуральные признаки — особенности роста микроба на питательных средах;

биохимические признаки — наличие у бактерий фермен­тов, необходимых для синтеза или расщепления (фер­ментации) различных химических соединений.

В бактериологической практике чаще всего изучают сахаро-литические и протеолитические ферменты.

К дополнительным признакам, используемым при идентифи­кации, относятся:

наличие видоспецифических антигенов (см. главу 10);

чувствительность к видоспецифическим бактериофагам (см. главу 5);

видовая резистентность к определенным антимикробным препаратам (см. главу 8);

для патогенных бактерий — продукция определенных факторов вирулентности (см. главу 9).

Тонкая внутривидовая идентификация до биовара (серова-ра, фаговара, ферментовара и т.д.) — типирование — основана на выявлении соответствующего маркера: антигена (серотипи-рование, см. главу 10), чувствительности к типовому бактери­офагу (фаготипирование, см. главу 5) и др.

В последние годы разработаны и начали применяться со­временные биохимические и молекулярно-биологические ме­тоды идентификации: хемоидентификация, анализ нуклеино­вых кислот: рестрикционный анализ, гибридизация, полиме-разная цепная реакция (ПЦР), риботипирование и др.

Изучение биохимических свойств аэробных и ана­эробных бактерий.

Незасеянный «пестрый ряд».

Варианты изменения «пестрого ряда».

«Пестрый ряд» для анаэробных бактерий.

Микрометод изучения биохимических свойств бакте­рий.

Рост бактерий, вырабатывающих пигменты.

Зарисовать варианты изменения «пестрого ряда».

Оценить результаты отсева чистой культуры: отметить наличие или отсутствие роста посеянной культуры, а также присутствие посторонних бактерий.

Убедиться в чистоте выделенной культуры, для этого приготовить мазок и окрасить его по методу Грама.

Поставить каталазную пробу на стекле и оценить ее результат.

Учесть результаты определения биохимической актив­ности выделенных чистых культур.

С помощью таблицы-определителя на основании изу­ченных морфологических, тинкториальных, культуральных и ферментативных свойств идентифициро­вать выделенные микробы.

Биохимическая идентификация. Для оценки биохимической активности бактерий используют следующие реакции:

1) ферментацию — неполное расщепление субстрата до промежуточных продуктов, например ферментацию угле­водов с образованием органических кислот;

окисление — полное расщепление органического суб­страта до СО₂ и Н2О;

ассимиляцию (утилизацию) — использование субстрата для роста в качестве источника углерода или азота;

диссимиляцию (деградацию) субстрата;

Классический (традиционный) метод идентификации мик­робов по биохимическим признакам заключается в посеве чис­той культуры на дифференциально-диагностические среды, со­держащие определенные субстраты, с целью оценки способ­ности микроорганизма ассимилировать данный субстрат или определения конечных продуктов его метаболизма. Исследова­ние занимает не менее 1 сут. Примером является оценка саха-ролитической активности бактерий (способности ферментиро­вать углеводы) с помощью посева на среды Гисса — короткий и длинный «пестрый ряд».

Идентификация бактерий по биохимическим признакам с помощью сред «пестрого ряда». Корот­кий «пестрый ряд» включает жидкие среды Гисса с моно- и дисахаридами: глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой и с 6-атомным спиртом — маннитом. В длинный «пестрый ряд» наряду с перечисленными углеводами вводят среды с разнооб­разными моносахаридами (арабиноза, ксилоза, рамноза, галак­тоза и др.) и спиртами (глицерин, дульцит, инозит и др.). Для оценки способности бактерий ферментировать углевод в среды добавляют индикатор (реактив Андреде или др.), позволяющий выявить образование кислых продуктов расщепления (органи­ческих кислот), и «поплавок» для обнаружения выделения СО₂.

Чистую культуру исследуемого микроорганизма засевают пет­лей в среды «пестрого ряда». Посевы инкубируют при 37 «С в течение 18—24 ч или больше. В том случае, если бактерии ферментируют углевод до образования кислых продуктов, на­блюдается изменение цвета среды; при разложении углевода до кислоты и газообразных продуктов наряду с изменением цвета появляется пузырек газа в поплавке. Если используют среды с полужидким агаром, то образование газа регистриру­ется по разрыву столбика. При отсутствии ферментации цвет среды не меняется. Поскольку бактерии ферментируют не все, а только определенные для каждого вида углеводы, входящие в состав сред Гисса, наблюдается довольно пестрая картина, поэтому набор сред с углеводами и цветным индикатором называют «пестрым рядом» (рис. 3.2.1; на вклейке).

Для определения протеолитических ферментов производят посев культуры бактерий уколом в столбик 10—20 % желатина, пептонную воду. Посевы в желатине инкубируют при 20—22 °С в течение нескольких дней. При наличии протеолитических ферментов бактерии разжижают желатин, образуя фигуру, на­поминающую воронку или елочку.

В посевах в пептонную воду определяют продукты расщеп­ления аминокислот после инкубирования в течение 2—3 сут при 37 °С путем постановки реакций на аммиак, индол, серово­дород и др.

Реакция на аммиак. Узкую полоску лакмусовой бу­маги укрепляют под пробкой так, чтобы она не соприкасалась с питательной средой. Посинение бумаги свидетельствует об образовании аммиака.

Реакция на индол. Способ Эрлиха: в пробирку с куль­турой бактерий прибавляют 2—3 мл эфира, содержимое энер­гично перемешивают и добавляют несколько капель реактива Эрлиха (спиртовой раствор парадиметиламидобензальдегида с хлористоводородной кислотой). В присутствии индола наблю­дается розовое окрашивание, при осторожном наслаивании образуется розовое кольцо (см. рис. 3.2.1).

Реакция на сероводород. В пробирку с пептонной водой помещают узкую полоску фильтровальной бумаги, смоченную сульфатом железа, и закрепляют ее под пробкой так, чтобы она не соприкасалась с питательной средой. При выделении серо­водорода образуется нерастворимый сульфид железа (FeS), ок­рашивающий бумагу в черный цвет (см. рис. 3.2.1). Продукцию H2S можно определять также путем посева культуры бактерий уколом в столбик с питательной средой, содержащей реактивы для выявления b^S (смесь солей: сульфат железа, тиосульфат натрия, сульфит натрия). Положительный результат — среда приобретает черный цвет за счет образования FeS.

Обнаружение каталазы. На предметное стекло нано­сят каплю 1—3 % раствора пероксида водорода и вносят в нее петлю с бактериальной культурой. Каталаза разлагает пероксид водорода на кислород и воду. Выделение пузырьков газа свидетельствует о наличии у данного вида бактерий ката­лазы.

В бактериологической практике иногда ограничиваются изучением сахаролитических и протеолитических признаков исследуемых бактерий, если этого достаточно для их иденти­фикации. При необходимости исследуют другие признаки, на­пример способность к восстановлению нитратов, карбоксили-рованию аминокислот, образованию оксидазы, плазмокоагула-зы, фибринолизина и других ферментов.

Результаты работ по идентификации выделенной культуры протоколируют (табл. 3.2.1).

Биохимические тесты 2-го поколения, основанные на при­менении концентрированных субстратов и более чувствитель­ных методов обнаружения конечных продуктов реакции, по-

Морфо- Окраска Характер Биохимические свойства Наимено- логия по методу роста вание Грама 1 1 1 рода и ферментация обра- вида зова- ние

водных). Это позволяет различать микробы, принадлежащие к разным видам, по количественному и качественному со­ставу липидов (жирных кислот, эфиров, спиртов, хинонов и т.д.). Анализ химического состава микробных клеток осу­ществляется с помощью метода хроматографии. Наиболее широко используют метод газожидкостной хроматографии. Ведущей областью применения метода являются идентифи­кация анаэробных бактерий по составу жирных кислот с короткой углеродной цепью (9—20 атомов углерода), относя­щихся к основным продуктам метаболизма этих микроорганиз­мов, а также идентификация медленно растущих бактерий (микобактерий) и бактерий с низкой ферментативной актив­ностью.

Молекулярно-генетические методы идентификации. Они ос­нованы на анализе бактериальных ДНК.

Рестрикционный анализ. ДНК обрабатывают рестрикционными ферментами — специфическими эндонуклеазами, которые разрезают молекулу ДНК по определенным по­следовательностям нуклеотидов. Далее проводят анализ полу­ченных фрагментов, уникальных для каждого вида микроорга­низма. Метод также позволяет осуществлять внутривидовое типирование бактерий.

Гибридизация ДНК. Любой микроорганизм имеет в своем геноме определенные уникальные последовательности, которые могут быть использованы для его идентификации. Метод обнаружения таких участков ДНК основан на способ­ности комплементарных последовательностей нуклеиновых кислот к гибридизации. Исследование проводят с помощью нуклеиновых зондов — однонитевых фрагментов ДНК, ком­плементарных уникальным участкам микробного генома и не­сущих метку (радионуклид, фермент или флюорохром). Вклю­чение метки обеспечивает высокую чувствительность метода. В зависимости от выбранного генетического фрагмента зонды могут быть родо-, видо- или типоспецифическими. Быстрота и высокая чувствительность метода гибридизации позволяют существенно сократить время исследования. Основной облас­тью применения является идентификация трудно культивиру­емых или медленно растущих микробов (например, представи­телей родов Mycobacterium, Neisseria, Campy lobacter). Особо сле­дует выделить метод риботипирования — идентификации, осно­ванной на анализе генов, кодирующих рибосомальные РНК.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Метод ПЦР позволяет обнаруживать уникальные последовательности ДНК, присутствующие в образце в очень малых количествах. Теоретически достаточно одной копии искомой последователь­ности. Метод ПЦР основан на амплификации (увеличении числа копий) искомого участка генома микроорганизма. С этой целью образец инкубируют в буферном растворе с двумя ко­роткими ДНК-олигомерами (праймерами), комплементарны­ми концам известного фрагмента генома, термостабильной ДНК-полимеразой и нуклеотидами. После гибридизации олигомеров с комплементарными участками ДНК они служат праймерами для полимеразы, которая копирует искомый фраг­мент. Образец многократно нагревают для разделения цепей двойной спирали ДНК и остужают для повторной гибридиза­ции праймеров с комплементарной матрицей. Каждая копия ДНК становится новой матрицей для синтеза новой копии. Процедуру повторяют 20—40 раз. При этом количество копий искомого фрагмента генома увеличивается по экспоненциаль­ному закону. Амплификация в миллионы раз занимает всего несколько часов.

Источник